[albert52]

Продолжим.

Помимо убиквитина, у млекопитающих существует более дюжины убиквитин-подобных молекул (Ubls), которые все активируются эквивалентным ферментативным каскадом для конъюгации со своими родственными субстратами. Один из этих путей конъюгации с Ubl включает NEDD8, молекулу Ubl, которая имеет примерно 60% сходства последовательностей с убиквитином. Как и убиквитинирование, неддилированные субстраты, в частности кулины - регуляторный каркас мультисубъединичных E3-лигаз - играют критическую роль в пролиферации клеток.

Подобно убиквитинированию, конъюгация зрелого NEDD8 с белками-мишенями осуществляется мультиферментным каскадом E1-E2-E3. Зрелый NEDD8 конъюгируется с белками-мишенями АТФ-зависимым образом посредством последовательных реакций, катализируемых последовательно E1 (NAE), E2 (Ubc12) и E3. С помощью этих ферментов C-концевой глицин NEDD8 образует изопептидную связь с лизином целевого белка. Денеддилазы, такие как CSN и NEDP1, деконъюгируют NEDD8 из недилированных белков перед протеосо -мой, захватывающей высвобождающийся субстрат.

NAE - единственный специализированный NEDD8 E1, но помимо NAE, фермент, активирующий убиквитин E1, UBE1 также может функционировать как атипичный NEDD8 E1, опосредуя присоединение NEDD8 к цепи убиквитина. Другие убиквитин-лигазы, такие как MDM2, c-Cbl, паркин и IAP, также могут функционировать как лигазы E3 NEDD8, способствуя неддилированию различных клеточных белков.

Основными известными субстратами модификации NEDD8 являются Cullin - субъединицы убиквитинлигаз E3 на основе Cullin, которые активны только при неддилировании. Их NEDDylation является критическим для рекрутирования E2 в лигазный комплекс, тем самым облегчая конъюгацию убиквитина, то есть NEDD8 является модулятором процесса убиквитинирования. Путь NEDD8, по-видимому, влияет на функцию UPS, по крайней мере, посредством регулирования активности убиквитинлигазы, антагонизма убиквитинированию или контроля удлинения убиквитиновой цепи.

Неддилирование регулирует активность CRL, самого большого известного класса убиквитинлигаз. CRL состоит из каркасного белка cullin, белка RING Rbx1, который рекрутирует убиквитин E2, адаптивного белка Skp1, который взаимодействует с белком F-бокса, и самого F-бокса, распознающего субстрат. Сочетая индивидуальный кулин (всего их 7 видов) с различными белками F-бокса, CRL контролируют деградацию огромного количества клеточных белков и, что неудивительно, участвуют во многих аспектах биологических процессов.

CRLs составляют ~ 20% всей протеасомной деградации в клетке, а многие CRL-белки связаны с опухолевым генезом. Так, при апоптозе комплекс, образующийся после активации рецепторов смерти TRAIL-R1 / R2 (DR4 / DR5), называется сигнальным комплексом, индуцирующим смерть (DISC), состоящим из рецепторов, адапторной молекулы FADD, прокаспазы-8 и FLIP. FADD рекрутирует прокаспазу-8 в этот комплекс, где она образует гетеродимер с длинной формой FLIP (L)), регулирующей ее процессинг и активность .

Cullin-3 взаимодействуя с TRAIL-R2 DISC, способствует K63-связанному убиквитинированию p10-субъединицы каспазы-8, что усиливает ее ферментативную активность и индукцию апоптоза. Связь p43-FLIP (L) с TRAIL-R2 DISC усиливает его взаимодействие с SCF Skp2 (см. ниже), что приводит к нацеливанию p43-FLIP (L) на протеасомы и снижение уровней гетеродимера FLIP (L): каспаза-8. Так возникает конкуренции между SCF Skp2 и каноничес -кимии белками DISC за связывание p43-FLIP (L). Таким образом Cullin-1 регулирует DISC главным образом посредством модуляции FLIP (L).

Недилирование кулинов запускает сборку функциональных CRL, приближает заряженный убиквитином E2 и субстрат и способствует переносу убиквитина к субстратам. После завершения убиквитинирования CSN делает возможным денеддилирование кулинов, что приводит к разборке CRL и высвобождению убиквитина E2 для следующего раунда убиквитинирования.

Такие Е3 лигазы, как Mdm2, Рarkin и Smurf1, также могут быть модифицированы с помощью NEDD8, и такая модификация влияет на их убиквитинлигазную активность. Например, Smurf1 представляет собой убиквитинлигазу HECT, неддилирование которого усиливает его ассоциацию с убиквитин E2, что играет решающую роль во многих процессах, включая развитие клеточного цикла, пролиферацию клеток, дифференцировку, поддержание стабильности генома и метастазирование. Так, при колоректальном раке человека повышенная экспрессия Smurf1, NEDD8, NAE1 и Ubc12 коррелирует с прогрессированием рака.

Показано также, что неддилирование ряда клеточных белков, таких как PINK1, HuR и RCAN1, противодействует убиквитинированию и увеличивает их стабильность. Например, HuR представляет собой РНК-связывающий белок, который регулирует пролиферацию и выживаемость клеток. HuR модифицируется NEDD8 по его лизинам 283, 313 и 326, что опосредуется NEDD8 E3 лигазой Mdm2. Неддилирование HuR подавляет его убиквитинирование, увеличивает его стабильность и способствует его ядерной локализации.

Также возможно, что при (протеотоксическом) стрессе, NEDD8 функционирует как заменитель убиквитина и блокирует убиквитиновую цепь, таким образом предотвращая чрезмерное удлинение убиквитиновой цепи и истощение пула убиквитина, что в противном случае было бы катастрофично для клеток.

Активированный NEDD8 необходим в двух путях репарации ДНК: NER и NHEJ, при этом накопление NEDD8 в сайтах повреждения ДНК является очень динамичным процессом. Неддилирование необходимо в течение короткого периода суб-пути глобальной репарации генома (GGR) - эксцизионной репарации ДНК (NER). В GGR NER после того, как повреждение ДНК вызвано УФ-облучением, Cul4A в комплексе белка 2 связывания повреждений ДНК ( DDB2 ) активируется NEDD8, и это позволяет GGR-NER приступить к устранению поврежде -ния.

Неддилирование также играет роль в восстановлении двухцепочечных разрывов. Негомологичное соединение концов (NHEJ) - это путь репарации ДНК, часто используемый для репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Первый шаг на этом пути зависит от гетероди -мера Ku70 / Ku80, который образует высокостабильную кольцевую структуру, охватыва -ющую концы ДНК. Но гетеродимер Ku должен быть удален, когда NHEJ завершается, иначе он блокирует транскрипцию или репликацию. Он убиквитилируется, чтобы способствовать высвобождению Ku и других факторов NHEJ из сайта репарации после завершения процесса.

Если активация NEDD8 ингибируется, клетки с индуцированным дефицитом NER или NHEJ могут погибнуть из-за недостаточной репарации ДНК, приводящей к накоплению повреж -дений ДНК. Эффект ингибирования NEDD8 может быть больше для раковых клеток, чем для нормальных клеток, так как они более активны в альтернативных путях репарации ДНК (см.выше). Ингибитор NAE, MLN4924 (певонедистат) индуцирует гибель клеток из-за неконтролируемого синтеза ДНК во время S-фазы клеточного цикла, приводя к повреждению ДНК и индукции апоптоза. MLN4924 взаимодействует с сайтом связывания нуклеотидов в NAE и образует ковалентный аддукт, который имитирует NEDD8-AMP, но не может участвовать в последующих реакциях, что приводит к блокированию функции NAE.

F-box белок SKP2 образует комплекс с CUL1, SKP1 и белком RING-пальца RBX1, вместе называемый SCF SKP2. SKP2 был впервые идентифицирован как критический регулятор клеточного цикла, потому что он убиквитинирует несколько важных регуляторов клеточного цикла, включая p27 KIP1 и p21 CIP1 , оба являются критическими ингибиторами CDK. SKP2 также играет критическую роль в EGFR-обеспечиваемом убиквитинировании AKT и рекрутировании мембран. Онкогенный потенциал SKP2 был предложен его избыточной экспрессией в различном злокачественных опухолях человека. Важно отметить, что эта сверхэкспрессия SKP2 показала обратную связь с p27 KIP1. Более того, уровни белка SKP2 могут служить прогностическим биомаркером, с более высокими уровнями, предсказывающими плохую выживаемость пациентов.

Cинтетический сompaund 25 нарушает взаимодействие между SKP1-SKP2 и, таким образом, отменяет активность лигазы SCF SKP2 . Он синергетически взаимодействуя с химиотерапевтическими агентами снижает выживаемость опухоли.

Мультидоменный связывающий белок 6 ретинобластомы (RBBP6) принадлежит к особому семейству эукариот и отсутствует у прокариот. Молекулярные функции RBBP6 включают метаболизм нуклеиновых кислот (репликацию, транскрипцию и сплайсинг пре-мРНК), активность убиквитинлигазы E3 и взаимодействие с p53 и белком ретинобластомы (RB1).

Белок контрольной точки сборки митотического веретена (MAD2L2) взаимодействует с RBBP6; он контролирует контрольную точку митоза. Он действует в комплексе с другими белками, чтобы напрямую ингибировать Cdc20, не позволяя ему активировать комплекс, способствующий анафазе (APC), убиквитинлигазу, которая важна для инициации сегрегации хромосом. Это означает, что RBBP6 действует на решающем этапе, когда сегрегация хромосом происходит в митозе и в мейозе. В противном случае может возникнуть анеуплоидия.

RBBP6 также обнаруживается в областях прикрепления ядерного матрикса (MAR), что указывает на участие в организации хроматина, где он рекрутирует p53 и Rb, а также член серин-аргининового подсемейства протеинкиназ, известных как SRPK1a, и факторы прикрепления матрикса, SAF-B и нуклеолин. Эти особенности дополнительно усиливают роль RBBP6 в организации хроматина.

RBBP6 экспрессируется на ранних стадиях развития человека и идентифицируется как «тот, кто рано встает»: он легко обнаруживается в ооците и сильно активируется на стадиях 2-8 клеток. RBBP6 также является одним из белков с более чем трехкратной экспрессией в плюрипотентной РНК эмбриональных стволовых клеток человека.