Продолжим.

В тройном негативном раке базально-подобный рак молочной железы (BLBC) является особенно агрессивным молекулярным подтипом, определяемым мощным кластером генов, экспрессируемых эпителиальными клетками в базальном или наружном слое взрослой молочной железы. В отличие от ER-положительных просветных опухолей и HER2-положительных опухолей, у базально-подобного подтипа обычно отсутствует экспрессия молекулярных мишеней, которые придают чувствительность высокоэффективным таргетным препаратам, таким как тамоксифен и ингибиторы ароматазы (ER) или трастузумаб (амплификация HER2).
Отметим, что тройные негативные опухоли, которые экспрессируют базальные маркеры, имеют отчетливые молекулярные повреждения ( например, нокдаун p53 и более высокие митотические показатели) и связаны с худшей выживаемостью, чем тройные отрицательные опухоли, в которых отсутствуют базальные маркеры .

BLBC чаще встречается у африканцев и афроамериканцев, а также у молодых женщин и женщин в пременопаузе (особенно среди афроамериканцев). Заболеваемость BLBC обратно пропорциональна продолжительности лактации. В отличие от опухолей просвета, BLBC чаще встречается у женщин с ранним началом менархе и первой доношенной беременностью до 26 лет. Хотя не было показано, что индекс массы тела достоверно связан с BLBC, как это имеет место для других молекулярных подтипов, повышенное соотношение талия-бедро положительно связано с BLBC у женщин в пременопаузе.

Несмотря на то, что опухоли TNBC / BLBC часто имеют большие опухоли на поздней стадии, они могут быть более чувствительными к предоперационной химиотерапии, о чем свидетельствуют более высокие показатели (22–45%) полного патологического ответа ( т. е. сами опухоли не обнаружены во время операции). Также среди пациентов с ER-отрицательным раком молочной железы (подтипы TNBC и HER2) в возрасте до 50 лет частота рецидивов в течение 5 лет в необработанной когорте составляет 38,8%, что снижается до 25,5% при комбинированной химиотерапии.
Важно отметить, что у пациентов, которые достигают патологического полного ответа, показатели выживаемости аналогичны показателям пациентов без TNBC / BLBC. Однако большинство женщин с TNBC / BLBC не имеют полного ответа и имеют высокий риск раннего рецидива в течение первых 2–5 лет после лечения, что приводит к общей более низкой 5-летней выживаемости.

TNBC / BLBC имеет характерный паттерн органоспецифических отдаленных метастазов с легкими, печенью и центральной нервной системой в качестве предпочтительных участков. Особенно разрушительным аспектом TNBC является высокая частота метастазов в паренхимe центральной нервной системе , которые наблюдаются у 46% женщин с метастатическим TNBC (6,7–9,6% всех случаев TNBC) и связаны с медианой выживаемости менее 5 месяцев с момента постановки диагноза.

Женщины с инактивирующими мутациями зародышевой линии в BRCA1 или BRCA2 имеют до 85% вероятности развития рака молочной железы в течение жизни. Потеря гетерозиготности (LOH) второго BRCA½ аллеля в эпителии молочной железы приводит к нарушению репарации двухцепочечной ДНК с помощью высокоточного пути репарации гомологичной рекомбинации. Вместо этого клетки полагаются на негомологичное соединение концов, которое подвержено ошибкам и может привести к хромосомным транслокациям, потому что репарация не связана с поврежденной последовательностью сестринской хроматиды ДНК.
Обычно наличие повреждения двухцепочечной ДНК приводит к остановке клеточного цикла и гибели клеток, но при наличии мутаций р53 остановка контрольной точки отменяется, что приводит к широкой нестабильности генома и анеуплоидии.

Спорадические фенотипы BLBC во многих аспектах наследственного рака молочной железы возникают у носителей BRCA1 (но не BRCA2 ). В частности, опухоли молочной железы у носителей BRCA1 и ненаследственного BLBC имеют следующие особенности:
1) они в основном носители тройного отрицания и базальны по профилю экспрессии генов и суррогатам биомаркеров;
2) они характеризуются высокой степенью развития опухоли, высокими митотически -ми показателями, мутациями р53 и хромосомной нестабильностью;
3) они часто имеют аномалии Х-хромосомы, включая дефекты в инактивации Х-хромо -сомы, хорошо известную функцию BRCA1;
4) они имеют сходные клинические признаки, в том числе молодой возраст на момент представления, плохой прогноз, ранние рецидивы и благоприятный ответ на химиотерапию, повреждающую ДНК.

Мутационная инактивация BRCA1 редко встречается при спорадическом раке молочной железы, а инактивация путем метилирования промотора CpG-острова, часто в комбинации с BRCA1 LOH наблюдается в 11–13% спорадических раков молочной железы, большинство из которых являются ER-негативными опухолями. Кроме того, было показано, что доминантно-негативный регулятор транскрипции ID4 регулирует экспрессию BRCA1 и преимущественно экспрессируется в BLBC.

BLBC также имеет высокую частоту (44–82%) мутаций TP53 , которые нарушают активацию и апоптоз контрольных точек, вызванные повреждением ДНК, тем самым способствуя нестабильности генома. Также EGFR рецепторная тирозинкиназа экспрессируется в 39–54% BLBC и придает устойчивость к апоптозу за счет лиганд-зависимой активации пути фосфатидилинозитол-3 (PI3) -киназа / Akt / mTOR.
Другой характерной апоптотической аномалией в BLBC является экспрессия молекулярного шаперона αB-кристаллина, который подавляет апоптоз путем ингибирования протеолитической активации проапоптотической протеазы каспазы-3. αB-Кристаллин экспрессируется в 45% BLBC и лишь редко (5%) в других молекулярных подтипах. Примечательно, что экспрессия αB-кристаллина связана с устойчивостью к предоперационной химиотерапии и плохой выживаемостью у пациентов с раком молочной железы.

Недавно определенная клаудиновая сигнатура с низкой экспрессией генов характеризуется низкой экспрессией генов клеточной адгезии ( например, Claudins и E-cadherin ), что приводит к фенотипу EMT. Опухоли с низким уровнем клаудина, наиболее тесно связанные с базисоподобным подтипом, обычно являются ER и HER2-отрицательными; такие опухоли составляют отдельный внутренний подтип экспрессии генов.

Фактор роста сосудистого эндотелия А (VEGFA / VEGF) является мощным митогеном для эндотелиальных клеток и регулирует ангиогенез опухоли и проницаемость сосудов, тем самым способствуя росту первичной опухоли и метастазированию. VEGF экспрессируется в приблизительно в 3 раза более высоких уровнях в TNBC по сравнению с не TNBC; ген VEGF расположен в хромосомной области (6p21.2–6p12.3), для которой в TNBC характерно частое увеличение числа копий.

В концепция синтетической летальности два онкогенных пути находятся в синтетической летальной взаимосвязи, если мутация любого онкогена хорошо переносится, но мутация обоих приводит к гибели клеток. Так, PARP и BRCA½ находятся в синтетических летальных отношениях: ингибиторы PARP потенциально индуцируют гибель клеток только в раковых клетках с мутациями в BRCA1 или BRCA2. Действительно, мутации в BRCA1 или BRCA2 придают 57- и 133-кратное увеличение чувствительности к ингибиторам PARP по сравнению с клетками с BRCA1 или BRCA2 дикого типа.

Дело в том, что лекарственные ингибиторы поли (АДФ) рибозо-полимеразы (PARP), фермента, участвующего в репарации ДНК-оснований, предотвращают восстановление одноцепочечных разрывов ДНК, которые превращаются в двухцепочечные разрывы на остановленных вилках репликации ДНК. Эти разрывы двухцепочечной ДНК обычно восстанавливаются с помощью BRCA½-опосредованного гомологичного рекомбинационного восстановления, и для клетки нет н***агоприятных последствий. Однако в присутствии BRCA1 или BRCA2 мутации, этот механизм репарации является дефектным: клетки накапливают двухцепочечные разрывы ДНК и в конечном итоге подвергаются апоптозу.

Продолжим.

Предшественники и преинвазивные поражения груди включают атипическую протоковую гиперплазию (ADH), протоковую карциному in situ (DCIS) и дольчатую неоплазию (LN). ADH - редкое заболевание, обнаруживаемое в 4% клинических доброкачественных биопсий, и по сути это небольшой очаг гиперплазии размером менее 2–3 мм. Значение диагноза ADH заключается в повышенном риске последующей инвазивной карциномы молочной железы IDC (относительный риск RR = 4,4).

Когда ADH сочетается с положительным семейным анамнезом, относительный риск инвазивного рака достигает 9,7. Основная проблема, связанная с ADH, - это трудность достижения приемлемого уровня соответствия или последовательности в диагнозе; так, пролиферация на краю биопсии может представлять собой периферию DCIS.

DCIS определяется как пролиферация злокачественных эпителиальных клеток в паренхиматозных структурах груди без признаков инвазии через базальную мембрану. В настоящее время DCIS составляет 15–20% злокачественных новообразований груди, выявляемых при скрининге, и известно, что такой диагноз повышает риск развития IBC (воспалительный рак груди) в 8-10 раз. Исследования показывают, что до 50% пациентов с микроскопическими очагами DCIS заболевают инвазивной карциномой, причем развитие инвазии связано с подтипом DCIS; комедонная форма (с кистами) прогрессирует в инвазивную карциному чаще и быстрее, чем DCIS низкой степени злокачественности. По данным маммографического скрининга, компонент DCIS присутствует в 30–60% IDC, причем пациенты с раком IDC с компонентом DCIS могут иметь менее агрессивное заболевание, чем у пациентов с чистой IDC груди.

LN характеризуется пролиферацией обычно мелких и часто слабо связанных клеток. Термин LN относится ко всему спектру атипичных эпителиальных пролифераций, возникающих в терминальной протоковой долевой единице (TDLU), с или без вовлечения терминальных протоков. При этом для оценки степени поражения используются термины ALH (атипичная дольчатая гиперплазия) и LCIS (лобулярная карцинома in situ); ALH увеличивает риск развития IBC в 3 раза, тогда как LCIS имеет относительный риск, равный 7.

В нормальной груди в пременопаузе ER (+) клетки составляют 7% от общей популяции эпителиальных клеток и равномерно распределены в просветном эпителии. Их число увеличиваются с возрастом, достигая плато после менопаузы. Экспрессия ER-альфа значительно повышена в гиперпластически увеличенной лобулярной единице (HELU), которая представляет собой самое раннее гистологически идентифицируемое поражение с предраковым потенциалом. Напротив, что касается увеличенных дольчатых единиц с столбчатым изменением (ELUCA), то более интенсивное окрашивание ER-альфа было связано с более низким риском последующей инвазивной карциномы.

В DCIS диптих ER (+) / Ki-67 (+) является отличительной чертой; при этом высокое соотношение ER-альфа / ER-бета при неатипичной эпителиальной гиперплазии, по-видимому, предсказывает прогрессирование до карциномы.

Подобно рецепторам эстрогена, рецепторы прогестерона (PR) повышены на очень раннем этапе предраковых поражений груди, а именно в (HELU). С другой стороны, зарегистрирована тенденция к снижению экспрессии PR при прогрессировании до злокачественного новообразования. При этом соотношение рецептора прогестерона A (PRA) / рецептора прогестерона B (PRB), по-видимому, играет центральную роль. В нормальной ткани молочной железы и неатипичной гиперплазии рецепторы гомогенно коэкспрессируются, но в начале прогрессирования один рецептор (особенно PRA при запущенных поражениях) преобладает. Следует отметить, что в нормальной ткани носителей мутации BRCA изоформа PRB совершенно отсутствует.

14-3-3 сигма это ген, экспрессия которого теряется при карциномах молочной железы, в первую очередь из-за опосредованного метилированием молчания. Он является негативным регулятором клеточного цикла и специфический маркером эпителия молочной железы человека, который подавляется в трансформированных клетках карциномы молочной железы. Он также был идентифицирован как продукт гена, индуцируемого р53, участвующий в контроле контрольных точек клеточного цикла после повреждения ДНК.

Важно отметить, что гиперметилирование локуса 14-3-3 сигма отсутствовало при гиперплазии без атипии, но выявлялось с возрастающей частотой по мере прогрессирования поражений груди от атипичной гиперплазии до DCIS и, наконец, до инвазивной карциномы. Метилированные аллели существовали также в перидуктальной стромальной ткани молочной железы.

Bcl-2 присутствует во всем спектре поражений молочной железы: преимущественно в доброкачественных поражениях, ADH, LN и хорошо дифференцированной DCIS. Более конкретно, наблюдается постепенное увеличение степени апоптоза и параллельное снижение экспрессии Bcl-2 в доброкачественных / предшественниках / преинвазивных / инвазивных поражениях по мере того, как они становятся гистологически более агрессивными.

BCL-2 локализован на внешней мембране митохондрий, где он играет важную роль в обеспечении выживания клеток и подавлении действия проапоптотических белков, включая члены его семейства. Проапоптотические белки семейства BCL-2, включая Bax и Bak , обычно действуют на митохондриальную мембрану, способствуя проницаемости и высвобождению цитохрома C и ROS , которые являются важными сигналами в каскаде апоптоза.

Bcl-2 в процессе апоптоза тесно взаимодействует с р53. Апоптоз, стимулированный р53, опосредуется двумя основными путями апоптоза, включая семейство В-клеточной лимфомы 2 ( Bcl-2) и каспазный каскад. Члены семейства Bcl-2 включают «мультидоменного» проапоптического члена семейства Bcl-2 Bax и членов «только BH3» Puma, Noxa и Bid. Домен BH3, короткий пептидный мотив, обнаруженный в некоторых белках семейства BCL-2, запускает ключевые митохондриальные события, связанные с апоптозом. Эти белки действуют выше Bax и вызывают активацию мультидоменных проапоптотических белков, а также являются прямыми мишенями для транскрипции через p53. р53 сам по себе может действовать как белок BH3 и противодействовать функции Bcl-2.

Преодоление антиапоптотического порога, установленного Bcl-2: p53-зависимые сигналы, включая индукцию «мультидоменного» Bax, и членов «только BH3» Puma и Noxa и прямое ингибирование Bcl-2, взаимодействуют с p53-независимыми сигналами, такими как индукция Bim, чтобы противодействовать функции Bcl-2 и способствовать апоптозу. р53 сам по себе может действовать как белок BH3 и противодействовать функции Bcl-2. Воздействие на клетки известных индукторов p53, таких как химиотерапия, вызывающая повреждение ДНК, или стрессы, которые активируют параллельные пути апоптоза, такие как лишение цитокинов, легко заставляют эти клетки превышать пороговое значение Bcl-2, чтобы вызвать апоптоз.

Напротив, инактивация любого отдельного пути апоптоза в клетках, экспрессирующих онкоген, может обеспечить уровень онкогенной активности, достаточный для стимуляции трансформации и туморогенеза. Так, при гиперплазии эпителия без атипии мутации р53 не обнаружены, но был констатирован мутированный p53 в ADH . Также мутации / накопление p53 присутствуют в значительном проценте DCIS, особенно у комедонов.

Продолжим.

Проапоптический BAK требует дополнительного этапа дефосфорилирования в процессе активации перед взаимодействиями с проапоптотическими белками, содержащими "только BH3", и последующих конформационных изменений, которые запускают BAK-зависимый апоптоз. Исследования показали, что киназа, отвечающая за поддержание BAK в неактивной конформации, представляет собой тирозинкиназу под названием BMX, которая, как сообщается, активируется при многих типах рака, включая рак груди, рак простаты, а также рак мочевого пузыря и другие. При ингибировании ВМХ BAK переходит в дефосфорилированное «активационно компетентное» состояние, которое более склонно к активации.

Фосфорилирование проапоптотического белка BH3 BID с помощью ATM / ATR является определяющим фактором того, подвергается ли клетка апоптозу после остановки митоза. Оказавшись в фосфорилированной форме в митозе, BID является более проапоптотическим, что делает его более зависимым от взаимодействия с белками семейства BCL-2 для его ингибирования и предотвращения апоптоза. Таким образом, фосфорилирование BID «готовит» клетки к апоптозу. Если митоз успешно завершен, происходит дефосфорилирование и снижается чувствительность к апоптозу. На основе этого механизма клетки, остановленные в митозе за счет добавления ингибиторов микротрубочек, таких как пакслитаксол, в сочетании с миметиками BH3, такими как ABT-737 или Navitoclax, значительно более сенсибилизированны к апоптозу.

Отметим, что нацеливание на апоптоз для лечения рака становится все более привлекательной стратегией, поскольку в настоящее время разрабатываются агенты для запуска внешнего апоптоза посредством передачи сигналов TRAIL или для предотвращения антиапоптотической активности белков BCL-2 или белков ингибитора апоптоза (IAP). Хотя уклонение от апоптоза является одним из отличительных признаков рака, многие виды рака имеют интактные сигнальные пути апоптоза, которые, если их разблокировать, могут эффективно убивать раковые клетки.

Напомню, что апоптоз (от греческого «опадание», как листья с дерева) преимущественно протекает двумя разными путями; внешние и внутренние пути апоптоза. Внешний путь инициируется внеклеточными проапоптотическими стимулами, включая лиганды клеточной смерти из семейства цитокинов TNF, которые действуют через рецепторы смерти, расположенные на поверхности клетки. Так, активация TRAIL приводит к его агрегации (TRAIL-R) и образованию DISC, в котором прокаспаза 8 активируется и инициирует апоптоз путем прямого расщепления нижестоящих эффекторных каспаз. Добавление либо агонистических антител TRAIL-R1 / R2, либо рекомбинантного человеческого TRAIL (rhTRAIL) использовалось для запуска внешнего пути апоптоза.

Внутренний путь инициируется внутриклеточными проапоптотическими сигналами, такими как повреждение ДНК или воздействие цитотоксических агентов и регулмруется семейством белков BCL-2, вызывающих образование пор на внешней мембране митохондрий и высвобождение апоптогенных факторов, таких как цитохром c или SMAC, из митохондрий. Высвобождение цитохрома с в цитозоль запускает активацию каспазы 9 за счет образова -ния комплекса апоптосом, содержащего цитохром c / Apaf-1 / каспазу 9. SMAC способствует активации каспаз за счет нейтрализации ингибирующего действия IAP. Каспазы 8 и 9 активируют каспазу 3/7, собственно вызывающую апоптоз.

Важно отметить, что существует перекрестное взаимодействие между двумя путями апоптоза через расщепление каспазой 8 BID, что приводит к усилению сигнала смерти. За активацией каспаз находится еще один уровень регуляции белков-ингибиторов апоптоза (IAP) через SMAC. Х-связанный ингибитор апоптиза (XIAP) способен ингибировать апоптоз путем прямого связывания и ингибирования каспаз 9 и 3/7, тогда как клеточные белки IAP (cIAP) подавляют активность каспазы косвенно через свою активность убиквитинлигазы, способствуя передаче сигналов выживания.

Антиапоптотические белки, включая BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BCL-W и BFL-1 / A1, прерывают этот проапоптотический каскад двумя способами. Во-первых, антиапоптотические белки могут связывать белки-активаторы BH3, предотвращая их взаимодействие и активацию BAX или BAK. Кроме того, антиапоптотические белки могут связываться с мономерными активированными формами BAX и BAK, у которых экспонируются их домены BH3. Это предотвращает гомоолигомеризацию BAX и BAK и, таким образом, предотвращает MOMP и апоптоз.

Так, механизм, лежащий в основе особой зависимости CLL (хронический лимфолейкоз) от BCL-2, связан с высокой экспрессией BCL-2. Однако этот обильный BCL-2 не обеспечивает достаточной защиты от дополнительной проапоптотической передачи сигналов, поскольку он уже занят большими количествами проапоптотического белка BIM. Когда миметик BH3 с небольшой молекулой, такой как венетоклакс, связывается с BCL-2, он замещает BIM, позволяя ему активировать BAX или BAK, вызывая олигомеризацию, MOMP (повышение проницаемости внешней мембраны митохондрий) и гибель клеток.

Когда раковые клетки подвергаются химиотерапии, происходит отбор по снижению чувствительности к апоптозу, что, вероятно, является важным фактором пан-резистентного фенотипа многих рецидивирующих опухолей. Апоптотическая гибель клеток обычно считается менее иммуногенной, чем другие типы гибели клеток, такие как некроз, поскольку быстрый фагоцитоз апоптотических клеток приводит к меньшему воздействию внутриклеточного содержимого на иммунную систему. Однако апоптотическая гибель клеток, тем не менее, может быть иммуногенной, возможно, за счет облегчения презентации антигена. В целом, однако, чем более быстрый и полный ответ in vivo, тем более вероятно, что основным типом гибели клеток является апоптоз, лучше всего документированный при гематологических злокачественных новообразованиях.

Профилирование BH3 - это метод, впервые разработанный для выявления опухолей, выборочно зависящих от отдельных антиапоптотических белков. Суть профилирования BH3 заключается в систематическом воздействии на митохондрии известных концентраций пептидов BH3 (имитируют проапоптотические функции белков, содержащих только BH3) и измерении полученного MOMP, который обычно рассматривается как точка необратимости апоптоза.

Например, митохондрии, чувствительные к пептиду NOXA BH3, зависят от MCL-1, а митохондрии, чувствительные к пептиду HRK BH3, зависят от BCL-XL. Так, пептид венетоклакс используется при CLL с хромосомной делецией 17p; эта делеция приводит к потере p53 и ранее предвещала очень плохой прогноз и отсутствие реакции на химиотерапию. Venetoclax, по-видимому, применяет апоптотический сигнал непосредственно к митохондриям, устраняя необходимость в передаче сигналов p53 для индукции апоптоза.

Наиболее эффективными лекарствами, которые у нас есть для больных раком, по-прежнему остаются обычные химиотерапевтические агенты. Поскольку они нацелены на повсеместные элементы, в основном ДНК и микротрубочки, не сразу понятно, почему они убивают раковые клетки лучше, чем нормальные клетки. Традиционные объяснения основываются на предположении, что скорость деления раковых клеток делает их уязвимыми для таких агентов. Однако клинические данные, подтверждающие это предположение, отсутствуют. Раковые клетки часто не делятся очень быстро in vivo по сравнению с нормальными тканями, а некоторые виды рака, такие как вялотекущие лимфомы, чувствительны к химиотерапии, а делятся очень медленно.

При рассмотрении механизмов терапевтического индекса традиционной химиотерапии рака важно признать, что чувствительность к одному агенту часто означает чувствительность к нескольким. Например, излечимость ОLL у детей зависит не только от чувствительности этого рака к стероидам, но и от его чувствительности к антрациклинам, алкилирующим агентам, алкалоидам барвинка, l-аспаргиназе и 6-меркаптопурину. Напротив, отсутствие вызванных химиотерапией ремиссий при почечно-клеточной карциноме является результатом не только устойчивости к платинам, но и устойчивости к таксанам, алкилирующим агентам, антрациклинам, алкалоидам барвинка и ингибиторам топоизомеразы. Эти наблюдения предполагают, что существует узел, который широко регулирует химиочувствительность.

Можно предположить, что этот узел представляет собой митохондриальный апоптотический путь. Одна из гипотез состоит в том, что все клетки осуществляют проапоптотическую передачу сигналов в ответ на яды ДНК или микротрубочек. Однако некоторые клетки располагаются близко к порогу приверженности апоптозу, тогда как другие располагаются дальше; первые клетки совершают апоптоз, тогда как вторые выживают.

Для проверки этой гипотезы использовалось профилирование BH3 с так называемыми неразборчивыми пептидами BH3, пептидами, которые связывают с высоким сродством все антиапоптотические белки. Чувствительность митохондрий к таким пептидам дает меру общего антиапоптотического резерва и, следовательно, близость к пороговому значению. Клетки или митохондрии, более чувствительные к этим пептидам, называются более праймированными.

В клинических экспериментах с ОМL, ОLL, CLL, множественной миеломой и раком яичников предварительное апоптотическое праймирование образцов рака пациентов предсказывало чувствительность к обычным схемам химиотерапии, предполагая, что дифференциальное праймирование было объяснением, лежащим в основе разной химиочувствительности опухолей. Более того, также обнаружено, что большинство нормальных клеток были очень плохо подготовлены к апоптозу, что дает объяснение терапевтическому индексу химиотерапии, который использовался в течение многих десятилетий.

Единственным исключением из этого наблюдения были белые кровяные тельца, которые относительно сильно праймированы. В этом отношении следует отметить, что потеря белых кровяных телец является очень частой ограничивающей дозу токсичностью большинства химиотерапевтических режимов.

Продолжим.

Ключевым признаком рака является бегство от онкосупрессивных путей , таких как апоптоз, аутофагии и торможение клеточного цикла. Уклонение от апоптоза во время канцерогенеза происходит за счет трех различных механизмов: нарушение передачи сигналов рецепторов смерти, потеря активности каспаз, а также нарушение баланса между антиапоптотическими и проапоптотическими белками. Терапевтические агенты, предназначенные для восстановления нормального функционирования сигнальных путей апоптоза, могут избавить более чем от 50% случаев рака человека, включая рак груди.

Флавипиродол, госсипол, депсипептид, ABT-737, ABT-264, фенретинид, HA 14-1 и GX15-070 - это некоторые из небольших молекул, которые ингибируют BCl-2, снижая их экспрессию. Также были разработаны небольшие молекулы, способные имитировать проапоптотические или антиапоптотические белки семейства BH3-only Bcl-2 для индукции апоптоза. ABT 737 является одним из примеров миметиков, содержащих только BH3, которые ингибируют экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl-xL, Bcl-2 и Bcl-W; первый таргетный препарат против Bcl-2, поступивший в клинические испытания на больных лейкемией, известен как облимерсен натрия.

Также ингмбиторы каспаз IAP являются привлекательными молекулярными мишенями. Некоторые новые методы лечения, направленные на XIAP, включали антисмысловые стратегии и короткие интерферирующие молекулы РНК (siRNA). Ингибирование XIAP привело с помощью лучевой терапии к улучшенному контролю опухоли in vivo. Также цисплатин последовательно снижает содержание XIAP и индуцирует апоптоз в цисплатин-чувствительных клетках.

Механизм действия малых молекул основан на их связывании с конкретными биополимерами, такими как белки и нуклеиновые кислоты, и действует как эффекторы для изменения функции или активности конкретного биополимера. При раке малые молекулы используются для восстановления мутировавших белков до их форм дикого типа и индукции активности белков, ответственных за устранение онкогенных клеток. В лекарственной терапии на основе р53 были исследованы несколько небольших молекул, которые могут восстанавливать функцию мутировавшего р53. Так, APR-246 превращается в активное соединение MQ, которое ковалентно связывается с мутантным p53, преобразовывая его в конформацию дикого типа2 и реактивируя p53-зависимый апоптоз; также дозозависимо снижает внутриклеточные уровни глутатиона.

Другая молекула, CDB3, представляющая собой синтетический пептид, производный от связывающего p53 белка (53BP2), взаимодействует с коровым доменом p53 и усиливает трансактивационную активность p53. Отметим, что после обработки только CDB3 апоптоз не индуцировался в клетках, несущих р53 дикого типа. Тем не менее, клетки показали повышенную чувствительность к апоптозу, индуцированному инфракрасным излучением

Наиболее продвинутыми из этих небольших молекул являются те, которые действуют, прерывая взаимодействие p53-MDM2, которое отвечает за инактивацию p53 дикого типа. К ним относятся нутлины, теновины и MI-219. MDM2 действует как негативный регулятор p53, связываясь с p53 и инактивируя его функцию с помощью ауторегулирующей петли обратной связи MDM2-p53. Эта активность MDM2 приводит к потере р53-опосредованного апоптоза в раковых клетках, что способствует канцерогенезу. Низкомолекулярные препараты MI-219 ответственны за дестабилизацию взаимодействий MDM2-p53, чтобы избирательно индуцировать апоптоз. Также Nutlin2 представляет собой низкомолекулярный ингибитор, который помещается в карман белка р53, где TP53 дикого типа связывается с MDM.

Отметим, что почти все без исключения низкомолекулярные фармацевтические препараты соответствуют «Правилам Липинского», включая высокую липофильность и молекулярную массу не более 500. В отличие от них, miRNA естественным образом не обладают этими лекарственными свойствами из-за их большого размера (два оборота двойной спирали нуклеиновой кислоты), почти 40 анионных зарядов за счет фосфодиэфирного остова и высокий молекулярный вес (более 13 кДа). Кроме того, miRNA нестабильны в сыворотке в результате разложения сывороточными нуклеазами, что способствует их короткому периоду полужизни in vivo. Поэтому используются siRNA дуплексы, имеющие стабильность в 600 раз большую, чем у природной РНК. siRNA могут быть сконструированы таким образом, чтобы соответствовать любому гену, их можно дешево производить и легко вводить в клетки.

Отметим, что эпигенетические модификации осуществляются метилированием ДНК, модификацией гистонов и интерференцией РНК (RNAi). Путь RNAi является обычным для многих эукариотических организмов. Термин «РНК-интерференция» (RNAi) был придуман для описания клеточного механизма, который использует собственную последовательность ДНК гена для его выключения - процесс, который исследователи называют « молчанием». У самых разных организмов, включая животных, растения и грибы, RNAi запускается двухцепочечной РНК (дцРНК) и играет важную роль в защите от вирусных вторжений вирусных нуклеотидов и транспозонов, изменений в развитии и экспрессии гена.

Центральным элементом RNAi являются три типа малых молекул РНК: miRNA, ShRNA и короткая интерферирующая или сайленсирующая РНК (siRNA). Она представляет собой класс молекул двухцепочечной некодирующей РНК , обычно длиной 20-27 пар оснований, подобных miРНК и действующих в рамках РНК-интерференции. Она препятствует экспрессии конкретных генов с комплементарными нуклеотидными последовательностями, разрушая мРНК после транскрипции, тем самым предотвращая трансляцию.

Важнейшими проблемами дизайна при выборе дуплексов siRNA для терапевтического использования являются эффективность и специфичность. В отношении специфичности миРНК есть два основных соображения: «нецелевое» из-за молчания генов, имеющих частичную гомологию с миРНК, и «иммунная стимуляция» из-за вовлечения компонентов врожденной иммунной системы дуплексом миРНК. Эффективность включения направляющей цепи дуплекса в комплекс RISC (РНК-индуцированного сайленсинга), возможно, является наиболее важным фактором, определяющим эффективность siRNA.

Вирусный белок E6 является еще одним тщательно изученным негативным регулятором р53 при раковых заболеваниях, связанных с ВПЧ (вирусом папилломы человека), таких как рак аногенитальной области, шейки матки, головы и шеи. Во время инфекции HPV экспрессия белка E6 увеличивается, чтобы облегчить репликацию HPV и интеграцию вируса в клетку-хозяин. Белок E6 достигает этого результата за счет использования своего Hect-домена лигазы E3 для связывания и разрушения клеточных белков-супрессоров опухолей p53 и pRB, тем самым устраняя способность клеток-хозяев инициировать остановку клеточного цикла и апоптоз. Терапевтические стратегии, направленные на нарушение взаимодействий E6-p53 в форме антисмысловых приложений и siRNA, специфичных для вирусного белка E6, привлекают наибольшее внимание в терапии рака, связанного с HPV.

Третий широко распостраненный белок, который, как предполагается, является еще одним негативным регулятором активного р53, особенно при прогрессировании рака молочной железы, известен как связывающий ретинобластому белок 6 (RBBP6). RBBP6 представляет собой белок 250 кДа, который обладает активностью лигазы E3. Его мРНК кодирует p53-связывающий домен, а также другие домены, известные как домен DWNN, домен цинкового пальца и домен безымянного пальца, которые ответственны за вездесущую природу RBBP6. RBBP6 является ассоциированным со сплайсингом белком и, следовательно, существует в различных других гомологах, известных как PACT и P2P-R. Нокдаун PACT усиливает взаимодействие p53-Hdm2 (MDM2), тем самым снижая полиубиквитинирование p53 с помощью RBBP6.

Будучи лигазой E3, RBBP6 напрямую взаимодействует с YB-1 через домен RING Finger, что приводит к убиквитинированию и деградации YB-1. Он также регулирует репликацию ДНК и стабильность хромосомных CFs посредством убиквитинирования и протеасомной деградации ZBTB18 (репрессора транскрипции, который играет роль в различных процессах развития, может играть роль в организации хромосом в ядре). RBBP6 может снижать экспрессию белка IκBα, ингибитора пути передачи сигналов NF-κB и активировать тем самым пути передачи сигналов NF-κB посредством убиквитинирования и деградации IκBα, а также дополнительно индуцировать EMT и метастазирование в CRC.

Сверхэкспрессия RBBP6 приводит к остановке клеточного цикла, общей прогрессии туморогенеза, и тесно связана с прогрессированием опухоли при раке шейки матки и пищевода. RBBP6 может играть решающую роль в злокачественном фенотипе рака человека. Трансфекция клеток рака легких siRBBP6 привела к снижению экспрессии RBBP6.

Интересвно, может ли трансфекция siRBBP6 усиливать гибель клеток, индуцированную паклитакселом или камптотецином? Клинические исследования пока не дали на это однозначный ответ и вообще пока почти все вышеупомянутые малые молекулы не дошли до клинического применения.

Вернемся к апоптозу.

Распространенные раковые клетки развили внутреннюю способность противостоять апоптозу, зависящему от закрепления (аноикис). Аноикис вызывается отсутствием клеточной адгезии, процесса, который лежит в основе формирования и поддержания просвета во время развития и гомеостаза молочной железы. В здоровых клетках анойкис в основном регулируется членами семейства белков B-клеточной лимфомы-2 (BCL2). Однако метастатические раковые клетки часто развивают аутокринные BCL2-зависимые механизмы устойчивости для противодействия аноикису.

Пролиферация, дифференцировка и инвазия до начала лактации обеспечивают формирование функциональной разветвленной протоковой сети молочных желез. В то же время их апоптотический потенциал должен подавляться до тех пор, пока не прекратится отлучение от груди и не будет индуцирована инволюция альвеол. Таким образом, регулируемый апоптоз поддерживает баланс между пролиферацией и гибелью клеток в нормальных тканях груди.

Раковый рост ткани молочной железы может иметь место, когда эпителиальные клетки молочной железы не в состоянии производить нормальные уровни про- и антиапоптотических белков, а избыток антиапоптотических факторов приводит к подавлению апоптоза. Впрочем, рак молочной железы с повышенным уровнем апоптоза и пролиферации из-за накопления генетических мутаций и нарушения регуляции экспрессии генов в клетках протоков молочной железы, вероятно, является опухолью высокой степени злокачественности. Так, экспрессия каспазы 3 сильно повышена в 58% DCIS и ~ 90% тканей инвазивного рака молочной железы, но не обнаруживается в нормальных клетках протоков молочной железы. Сильная экспрессия каспаз 3, 6 и 8 достоверно коррелирует с высокой степенью DCIS.

Поскольку высокая скорость апоптоза всегда связана с высоким уровнем пролиферации клеток, повышенная пролиферация активирует передачу сигналов апоптоза в клетках рака груди и вызывает апоптоз в популяциях клеток, которые относительно чувствительны к апоптозу. Это обеспечивает селективное преимущество для роста клеток рака молочной железы, которые разработали устойчивые механизмы для блокирования апоптотического ответа. Так, экспрессия каспазы 3 сильно повышена в 58% DCIS и ~ 90% тканей инвазивного рака молочной железы, но не обнаруживается в нормальных клетках протоков молочной железы,склонных к вызываемому каспазами апоптозу. Сильная экспрессия каспаз 3, 6 и 8 достоверно коррелирует с высокой степенью DCIS.

Проапоптотические белки можно разделить на две группы: многодоменные белки и белки, содержащие только BH3. Существует восемь белков, содержащих только BH3, причем они структурно очень разнообразны и имеют гомологию только в домене BH3. Взятые вместе, белки, содержащие только BH3, работают как сенсоры для множества клеточных стрессов в клетках млекопитающих. При этом каждому типу клеток требуется гомолог BCL2 для регуляции апоптоза; однако специфические проапоптотические белки необходимы для того, чтобы вызывать апоптоз в разных типах клеток и при разных обстоятельствах. Это позволяет клеткам реагировать на многочисленные внутриклеточные сигналы смерти. Например, NOXA и PUMA подвергаются регуляции транскрипции с помощью p53 и активируются при повреждении ДНК, вызванном УФ-излучением (NOXA) и γ-излучением (PUMA).

BIM и BMF являются двумя основными белками, содержащими только BH3, в развитии молочных желез, в основном из-за их ключевой роли в аноикисе и образовании просвета. В ответ на депривацию фактора роста или стресс в эпителиальных клетках молочных желез, BIM и BMF подвергаются прямой транскрипционной активации Fохо3а. Так, при физиологическом отделении эпителиальных клеток глобулоальвеол в них отсутствует устойчивая активность MAPK, позволяющая Fохо3а перемещаться в ядро ​​и транскрибировать BIM, тем самым запуская контролируемую гибель клеток.

Также JAK1-регулируемая активация транскрипционного фактора STAT3 сильно связана с транскрипцией BMF и в меньшей степени с транскрипцией BIM. STAT3-зависимая транскрипция BMF и BIM происходит специфически во время инволюции молочной железы. Ингибирующее действие белков IAP может быть антагонизировано несколькими белками-ингибиторами IAP, такими как Smac / Diablo и XIAP-ассоциированный фактор 1 (XAF1), чтобы вызвать апоптотический ответ.

BIMEL (сверхдлинная изоформа сплайсинга BIM) в закрепленных люминальных клетках, фосфорилированы активным сигнальным каскадом MAPK / ERK и эти клетки не будут подвергаться аноикису. Путь MAPK активируется ниже HER2 и EGFR и при активации этих рецепторов этот путь негативно регулирует апоптоз, частично из-за его ингибирования PTEN. В заякоренных в мембране клетках передача сигналов RTK приводит к активации MAPK, которая фосфорилирует BIMEL и тем самым индуцирует его ubiquitin-опосредованную деградацию и впоследствии ингибирует аноикос. Однако при раке молочной железы отслоившиеся эпителиальные клетки просвета молочной железы также содержат фосфорилированный BIMEL, несмотря на нарушение передачи сигналов RTK из-за отслоения клеток, и поэтому они сопротивляются BIM-опосредованному аноикису. Возникающее в результате наполнение просвета характерно для рака молочной железы in situ.

Белки, содержащие только BH3, являются опухолевыми супрессорами, причем BIM и BMF в молочной железе играют основную роль в подавлении опухолей. В отсутствие любого из этих белков супрессоров протоки молочных желез претерпевают заполнение просвета отслоившимися эпителиальными клетками. Существует терапевтический потенциал малых молекул, похожих на BMF, для восстановления аноики в эпителиальных клетках просвета молочной железы (см. выше).

AKT косвенно подавляет BIM и BMF через фосфорилирование и ингибирование их фактора транскрипции Fохо3а. Соответственно, цитозольная локализация FOXOs связана с плохой выживаемостью у пациентов с раком груди. Наконец, даже после высвобождения цитохрома с AKT может ингибировать апоптоз путем прямого фосфорилирования каспазы-9. Кроме того, AKT способствует выживанию клеток за счет стабилизации IAP.

Избыточная экспрессия BCL2 наблюдается в 85% случаев рака молочной железы ER +, возможно, из-за присутствия двух эстроген-чувствительных элементов в промоторе BCL2, при этом клетки рака груди используют как гормонозависимые (BCL2), так и -независимые средства (через MCL1 ), чтобы обойти BH3-опосредованный апоптоз, поддерживая рост опухоли и способствуя устойчивости к химиотерапии. Кроме того, антиапоптотический белок BCL-XL экспрессируется на низком уровне в нормальных эпителиальных клетках молочной железы, но сильно экспрессируется в 75% тканей карциномы молочной железы.

Рак яичников

Рак яичников - основная причина смерти среди всех гинекологических онкологических заболеваний в западных странах. По сравнению с другими гинекологическими видами рака, уровень смертности от рака яичников превосходит таковой от рака шейки матки и рака эндометрия вместе взятых. Такой высокий уровень смертности объясняется тем, что у большинства пациентов диагноз ставится на поздней стадии, что связано с относительным отсутствием специфических признаков и симптомов заболевания и отсутствием надежных тестов для раннего выявления.

Рак яичников - это высокометастатическое заболевание, характеризующееся широким распространением перитонеальной диссеминации и асцитом, и является основной причиной смерти от гинекологических заболеваний. Несмотря на агрессивное хирургическое вмешательство и химиотерапию на основе платины для пациентов с клинически распростненным раком яичников, общая пятилетняя выживаемость составляет всего 15–20% . Смертность, связанная с заболеванием, при карциноме яичников чаще всего является результатом метастазирования. На момент постановки диагноза в большинстве случаев заболевание распространилось за пределы яичников. Однако при раке яичников I стадии выживаемость может достигать 90%.

Существует более 30 типов и подтипов рака яичников; классифицируются на 3 основные категории в зависимости от первичных клеток, из которых они возникают. Они делятся на следующие категории: эпителиальные опухоли, стромальные опухоли и опухоли половых клеток. Эпителиальные опухоли яичников (карциномы яичников) являются наиболее распространенными и наиболее агрессивными; составляют около 90% всех случаев рака яичников.

К опухолям поверхностного эпителия относится большинство первичных опухолей яичников. Классификация эпителиальных опухолей яичников основана на типе гистологической дифференцировки опухолевых клеток и степени пролиферации эпителия.
Так, в зависимости от дифференцировки опухолевых клеток выделяют 3 основных гистологических типа опухолей: серозные, муцинозные и эндометриоидные. Степень пролиферации эпителия связана с биологическим поведением опухоли: согласно ей опухоли яичников делят на доброкачественные (минимальная пролиферация эпителия), пограничные (умеренная пролиферация эпителия) и злокачественные (выраженная пролиферация эпителия с признаками инвазии в строму).
Около 70% из них являются доброкачественными и пограничными, а 30% — злокачественными. Кроме того, доброкачественные опухоли часто классифицируют в зависимости от составляющих их компонентов на цистаденомы (опухоль представлена кистозными участками), цистаденофибромы (опухоль представлена кистозными и фиброзными участками) и аденофибромы (опухоль представлена преимущественно фиброзными участками). Пограничные и злокачественные опухоли также могут иметь выраженный кистозный компонент, злокачественные опухоли иногда обозначают как цистаденокарциномы. К моменту обнаружения опухоли могут иметь относительно небольшой размер или заполнять собой весь малый таз.

Самая распространенная теория происхождения эпителиальных опухолей яичников — трансформация целомического эпителия. Эта точка зрения основана на особенностях эмбриогенеза яичников, при котором из целомического эпителия образуются мюллеровы протоки, а из них формируется серозный (трубный), эндометриоидный (эндометриальный) и муцинозный (цервикальный) эпителий женских половых органов.
Опухоли этих трех типов эпителия развиваются преимущественно в яичниках, поскольку целомический эпителий часто внедряется в корковое вещество яичника с формированием эпителиальных инклюзионных кист; предполагается, что они являются результатом инвагинаций поверхностного эпителия, который впоследствии теряет связь с поверхностью. Такие кисты чаще всего выстланы мезотелием или трубным эпителием.

Карциномы яичников зависимости от их патогенеза делятся на (1) карциномы на фоне пограничных состояний; (2) карциномы de novo, т.е. без предшествующего поражения. При этом высокодифференцированные серозные, эндометриоидные и муцинозные карциномы часто имеют участки пограничных опухолей того же эпителиального типа, но это сочетание редко наблюдается при умеренно дифференцированных и низкодифференцированных серозных карциномах либо злокачественных смешанных мюллеровских опухолях. Результаты молекулярных исследований также поддерживают эту классификацию.

Гипотеза гонадотропинов предполагает, что повышенные уровни гонадотропинов (ФСГ и ЛГ) играют важную роль в развитии эпителиального рака яичников (EOC). Это подтверждает наблюдение, что ЭОК чаще всего диагностируются у женщин в постменопаузе, при этом средний возраст затронутых женщин составляет более 60 лет, у которых обычно наблюдается высокий уровень гонадотропинов в сыворотке крови. Кроме того, снижение риска EOC связывают с продолжительностью лактации, увеличением числа беременностей (многоплодие) и использованием оральных контрацептивов; при которых типичны либо более низкие уровни гонадотропинов, либо пониженная экспрессия их рецепторов.

Теория непрерывной овуляции предполагает, что частые вызванные овуляцией разрывы OSE без периодов отдыха, вызванных беременностью, являются возможной причиной EOCs. Эта теория предполагает, что повторяющиеся периоды апоптоза и митотического восстановления клеток поверхностного эпителия яичников (OSE) предрасполагают их к генетическим мутациям и геномной нестабильности, которые обычно предвещают начало неопластической трансформации.
Факторы, защищающие от EOC, такие как использование оральных контрацептивов, лактация и беременность, которые характеризуются ановуацией, согласуются с этой теорией. Кроме того, факторы риска, такие как нерожание и использование препаратов, стимулирующих овуляцию (лечение бесплодия), все характерные для непрерывной овуляции, также подтверждают эту теорию.

Отмечена высокая степень окислительного повреждения ДНК на клетках OSE вокруг места овуляции. Предположено, что если повреждение ДНК не восстанавливается, клетка может уклоняться от апоптоза, что приводит к появлению трансформированной клетки-предшественника, которая может размножаться во время митогенной репарации OSE после овуляции. Так, наиболее важным фактором риска, связанным с раком яичников, являются генетические мутации в генах репарации ДНК рака груди BRCA1 и / или BRCA2, которые распространены в семьях с историей рака груди и / или яичников. Мутации BRCA1 предоставляют 30 - 40% шанс заболеть раком, в то время как мутации BRCA2 показывают пожизненный риск 10-15%.

Синдром Линча (также называемый наследственным неполипозным колоректальным раком (HNPCC)) представляет собой мутацию зародышевой линии восстановления несоответствия, которая предрасполагает людей к определенным типам рака, включая рак прямой кишки, эндометрия и яичников. Примерно от 10 до 15% наследственных случаев рака яичников происходит у женщин с синдромом Линча. Более мягкий, менее агрессивный и генетически более стабильный пограничный рак яичников включает мутации KRAS, BRAF, PTEN и ß-catenin.

Около 50% раковых заболеваний человека показали инактивацию p53 в результате мутаций или потери, a в большинстве опухолей, сохраняющих p53 дикого типа, были обнаружены нарушения в p53 пути подавления опухоли. Именно такие опухоли чаще всего характеризуются злокачественным течением.

Продолжим.

Яичник показывает собой парадигму запрограммированной гибели клеток из-за циклической природы развития и функции яичников. Было показано, что апоптоз является основным механизмом гибели клеток в яичниках. Это наблюдалось при потере половых клеток (истощение зародышевых клеток), атрезии фолликулов и регрессии желтого тела (лютеолиз) и поверхностных эпителиальных клетках яичников до овуляции.

Атрезия фолликулов - это разрушение и рассасывание фолликулов яичников, которое происходит до овуляции. Лютеолиз происходит в конце женского репродуктивного цикла при отсутствии беременности. Молекулярные эффекторы, которые являются медиаторами лютеолиза, включают лиганд апоптоза Fas / Fas, простагландин F2α, эндотелины, интегрины и γ-интерферон.

Апоптоз при истощении зародышевых клеток: около семи миллионов ооцитов вырабатываются в яичниках на ранних этапах жизни человеческого плода. Однако вскоре после рождения происходит резкое сокращение количества ооцитов примерно до одной четверти вследствие апоптоза. Дефекты апоптоза или длительная пролиферация половых клеток могут привести к опухолям половых клеток яичника.

Апоптоз и гены, которые его контролируют, оказывают глубокое влияние на злокачественный фенотип. В яичниках Bcl-2 экспрессируется в основном в здоровых фолликулах яичников, в то время как Bax, которая является проапоптотической молекулой, экспрессируется в фолликулах, подвергающихся атрезии. Повышенные гонадотропины имеют тенденцию ингибировать экспрессию Bax, одновременно увеличивая экспрессию Bcl-2 и Bcl-xL, тем самым способствуя выживанию фолликула.

IAP являются эндогенными ингибиторами каспаз, и они могут ингибировать активность каспаз, связывая свои консервативные домены BIR с активными сайтами каспаз, способствуя деградации активных каспаз или удерживание каспаз от их субстратов; XIAP является наиболее мощным ингибитором апоптоза среди всех IAP. Так, выявлена аномальная экспрессия семейства IAP в раковых клетках поджелудочной железы, и эта аномальная экспрессия также является ответственной за их устойчивость к химиотерапии.

В нормальных яичниках повышение уровня ФСГ в яичниках активирует XIAP, что приводит к подавлению апоптоза гранулезных клеток и способствует росту фолликулов, индуцированному ФСГ. При раке некоторые новые методы лечения, направленные на XIAP, включали антисмысловые стратегии и короткие интерферирующие молекулы РНК (миРНК).

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), также известный как кахектин и TNFSF2, является прототипическим лигандом суперсемейства TNF. Это плейотропная молекула, которая играет центральную роль в воспалении, апоптозе и развитии иммунной системы. При нормальном развитии яичников экспрессия некоторых членов семейства TNF, таких как FasL / Fas, сильно зависит от уровней гонадотропинов. Повышение уровня гонадотропина приводит к снижению экспрессии Fas / FasL, что способствует выживанию фолликулов. Однако снижение уровня гонадотропина приводит к повышенной экспрессии Fas / FasL, что приводит к атрезии фолликулов.
TNF-α запускает апоптоз, активируя каспазы; с другой стороны, TNF-α способен способствовать выживанию клеток гранулезы за счет усиления экспрессии XIAP через систему NFκB.

TRAIL - еще один член семейства TNF, который, как было выше показано, индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, но не в нормальных клетках, из-за присутствия рецепторов-ловушек TRAIL, которые конкурентно ингибируют путем связывание лигандов TRAIL с родственными рецепторами.

Интерфероны (IFN): IFN-γ является мощным иммуномодулирующим, противовирусным и антипролиферативным цитокином, обладающим противораковой активностью. Они включают IFN-α, IFN-γ, IFN-β и IFN-δ; IFN-γ непосредственно подавляет рост опухолевых клеток человека. Интерфероны сенсибилизируют клетки к индуцирующим апоптоз генам и белкам в путях апоптоза.
IFN-γ мог бы быть полезным биологическим лечением эпителиального рака яичников человека, если бы устойчивые уровни этого цитокина могли быть достигнуты в брюшине за счет улучшенных стратегий доставки белков или генов.

Интегрины: это рецепторы трансмембранных белков, содержащие α- и β-гетеродимерные цепи и короткий хвост в цитоплазматической области. Они обладают адгезионными свойствами, которые соединяют мембрану с цитоскелетом и способны влиять на выживание и гибель клеток. Они участвуют в пролиферации клеток через пути передачи сигналов, активируя протеинкиназы.

Интегрины экспрессируются на поверхности примордиальных фолликулярных клеток, способствуя их адгезии с внеклеточным матриксом. Интегрины слабо экспрессируются в атретических третичных фолликулах и отсутствуют в атретических первичных и вторичных фолликулах. Клетки гранулезы, у которых отсутствует экспрессия, являются единственными, которые подвергаются апоптозу.

Для лечения рака яичников были исследованы различные целевые терапевтические стратегии, которые часто используются в сочетании с химиотерапевтическими агентами для достижения максимальных результатов. Отметим, что более чем в 70% случаев химиотерапевтического лечения рака яичников наблюдается резистентность к препаратам на основе платины и паклитакселу и последующий рецидив.

Направленные противораковые препараты можно разделить на две широкие категории: ингибиторы киназ и моноклональные антитела. Тирозинкиназы - это молекулы, которые играют решающую роль в передаче сигналов, достигая кульминации своего действия путем регулирования транскрипции генов в ядре. Они функционируют, передавая γ-фосфатные группы от АТФ к гидроксильной группе белковых молекул, ответственных за передачу сигнала. Наиболее важные клеточные процессы, такие как клеточный цикл, дифференцировка, подвижность и апоптоз или выживаемость клеток, находятся под скрупулезной регуляцией тирозинкиназ.

Тирозинкиназы сверхэкспрессируются или мутируют в нескольких типах опухолей у людей, включая опухоли яичников, что делает их хорошими мишенями для лечения рака. Небольшие молекулы были разработаны для нацеливания на тирозинкиназы, в то время как моноклональные антитела нацелены на поверхностные белки или антигены, которые дифференциально экспрессируются, сверхэкспрессируются или мутируют в раковых клетках по сравнению с нормальными тканями.
Моноклональные антитела действуют, вызывая изменения в функции рассматриваемого антигена или рецептора, такие как вызов иммунного ответа или конъюгирование лекарственного средства с антителом, которое нацелено на конкретный антиген.

Так, плохой прогноз при раке яичников связан с повышенной экспрессией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который выполняет такие функции, как ангиогенез, митогенез, повышение проницаемости сосудов и выживаемость эндотелиальных клеток. Низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы при раке яичников нацелены на лиганд и рецептор VEGF , тем самым замедляя ангиогенез и улучшая прогноз заболевания.

Также около 70% случаев рака яичников демонстрируют повышенную экспрессию EGFR, сверхэкспрессия которого коррелирует с химиорезистентностью и плохим прогнозом. Ингибиторы тирозинкиназы, такие как эрлонитиб и гефитиниб, действуют против EGFR, правда при прогрессировании заболевания и рецидивах с низкой эффективностью.

Aurora A - серин-треониновая киназа, которая необходима для многих важных клеточных функций, таких как митоз, формирование веретена и разделение центромер. Сверхэкспрессия Aurora A, а также амплификация местоположения его гена часто отмечались в опухолях человека, в том числе при карциномах яичников. Было показано, что Aurora A ингибирует апоптоз, опосредованный паклитакселом и цисплатином, в раковых клетках яичников. Ингибирование киназы Aurora с помощью небольшой молекулы MK0457 в сочетании с химиотерапией (доцетаксел) показало значительное снижение пролиферации клеток и роста опухоли.

BRCA1 и BRCA2 играют важную роль в восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК и поддержании стабильности генома. Мутации в этих генах составляют от 5 до 10% всех случаев рака яичников, причем более чем в 50% случаев серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности наблюдается потеря функции генов BRCA по генетическим или эпигенетическим причинам.

Поли-АДФ-рибозная полимераза (PARP) представляет собой ядерный фермент, участвующий в репарации одноцепочечных разрывов ДНК. Он активируется при повреждении ДНК, и его ингибирование приводит к одноцепочечным разрывам ДНК, что в свою очередь может привести к двухцепочечным разрывам. Пациенты с BRCA1 и BRCA 2 проявляют высокую чувствительность к ингибиторам PARP, например к олапариб (создан небезызвестной AstraZeneca). Однако он одобрен только для пациенток с мутацией BRCA (это та самая мутация, из-за которой Анджелина Джоли приняла решение удалить себе молочные железы и яичники). Дело в том, что он работает лучше у BRCA-мутантных больных, и когда BRCA он не работает, клетка вынуждена пользоваться обходными путями, такими как PARP.

Препарат niraparib показал преимущество по безрецидивному выживанию не только у пациенток с мутацией BRCA, но и без неё. У пациенток с мутацией препарат увеличил медиану времени выживаемости без прогрессирования с 5,5 до 21 месяца по сравнению с плацебо, а у пациенток без мутации — с 3,9 до 9,3 месяцев.

От 50% до 80% случаев рака яичников демонстрируют активацию рецептора PDGF (фактора роста тромбоцитов) в результате мутаций, генетической амплификации или хромосомных перестроек. Значительная индукция апоптоза и уменьшение веса опухоли, когда мезилат иматиниба (STI571), нацеливаный на рецептор PDGF, использовался в комбинации с паклитакселом. Однако сам по себе STI571 не вызвал каких-либо значительных эффектов.

Продолжим.

Карциномы яичников неоднородны и в основном классифицируются по типу клеток на серозные, муцинозные, эндометриоидные, светлоклеточные и Бреннеровские (переходные) опухоли, соответствующие различным типам эпителия в органах женского репродуктивного тракта.

В современной модели опухоли яичников делятся на две группы, обозначенные как тип I и тип II. Серозная карцинома низкой степени злокачественности (MPSC) представляет собой прототипную опухоль типа I и развивается поэтапно от атипичной пролиферативной опухоли через неинвазивную стадию MPSC (обе эти опухоли квалифицируются как пограничные), прежде чем стать инвазивной.
Поскольку серозные пограничные опухоли (SBT) редко связаны с инвазивной серозной карциномой, они представляют собой отдельную сущность, не связанную с инвазивной карциномой. Тем не менее, SBT иногда прогрессируют до карциномы, и поэтому должна существовать некоторая взаимосвязь. Напротив, муцинозные пограничные опухоли (МВТ) часто связаны с инвазивной муцинозной карциномой.

Серозная карцинома высокой степени злокачественности представляет собой прототипную опухоль типа II и развивается из поверхностного эпителия яичников или кист включения без морфологически распознаваемых промежуточных стадий. KRAS и BRAF мутации в этих новообразованиях, в отличие от ТР53, обнаруживаются редко. Они очень агрессивны и быстро распространяются, учитывая их продвинутую стадию на момент обращения.

В опухолях I типа гистологические переходы от аденофибром и атипичных пролиферативных серозных опухолей (APST) к неинвазивным MPSC наблюдаются почти в 75% случаев. Кроме того, в значительной части случаев обнаруживаются области инфильтративного роста (инвазии стромы), непосредственно прилегающие к неинвазивному компоненту. Гистологически характеризуется небольшими плотными гнездами и микропапиллами, беспорядочно инфильтрирующими строму. Эти инвазивные MPSC являются синонимом серозной карциномы низкой степени злокачественности.

APST и неинвазивный MPSC можно рассматривать как аналог дисплазии и карциномы in situ шейки матки. То есть APST - это доброкачественная пролиферативная опухоль, которая может прогрессировать до неинвазивного MPSC, который является непосредственным предшественником инвазивной микропапиллярной серозной карциномы низкой степени злокачественности.

Серозная карцинома низкой степени злокачественности обычно протекает безболезненно и может длиться более 20 лет. Приблизительно от 50 до 60% пациентов в конечном итоге умирают из-за широко распространенного внутрибрюшного карциноматоза, но опухоль сохраняет свой гистологический тип и низкий индекс пролиферации на протяжении всего процесса. Такие опухоли с небольшими очагами, демонстрирующими микропапиллярную архитектуру, обозначают как «микрокарциному.

Цитологически инвазивный MPSC состоит из относительно однородной популяции клеток с небольшими округлыми ядрами, часто содержащими небольшое, но заметное ядрышко; многоядерность практически отсутствует. Такие карциномы составляют примерно 10% всех серозных карцином. По шкале от 1 до 3 эта степень ядерной атипии квалифицируется как степень 1.

Мутации KRAS и BRAF по-видимому, возникают на очень ранней стадии развития MPSC низкой степени злокачественности, о чем свидетельствует демонстрация того, что те же мутации KRAS и BRAF, обнаруженные в SBT, обнаруживаются в эпителии цистаденомы, соседнем с SBT. Мутации в TP53 очень редки.

Онкогенные мутации в BRAF, KRAS и ERBB2 приводят к конститутивной активации пути пере -дачи сигнала митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), причем KRAS мутации в кодонах 12 и 13 встречаются в одной трети инвазивных низкосортных MPSC и еще в одной трети SBT. Точно так же мутации BRAF в кодоне 600 встречаются в 30% серозных карцином низкой степени злокачественности и в 28% случаев SBT. Мутации в KRAS, BRAF и ERBB2 исключают друг друга (как в колоректальном раке), а прогрессирование APST до MPSC имитирует последовательность аденома-карцинома.

Напротив, опухоли типа II с самого начала агрессивны и высокой степени злокачественности, и, поскольку предшествующие поражения не были идентифицированы, считается, что они возникают de novo. В эту группу входят серозная карцинома высокой степени злокачественности, смешанные злокачественные мезодермальные опухоли (MMMT) и недифференцированные карциномы.

Поскольку многие из этих опухолей имеют микропапиллярную архитектуру, можно предположить, что они возникли из подгруппы серозных карцином низкой степени злокачественности, в которых отсутствовали мутации KRAS, BRAF и ERBB2 . Последующее приобретение TP53 мутация могла привести к генетической нестабильности, которая, в свою очередь, способствовала повышению уровня ядерной атипии (степень 2), вплоть до сильно плеоморфных, часто многоядерных клеток (степень 3).

Значительное количество «карцином яичников» типа II развивается за пределами яичника, в частности, брюшины и маточной трубы, и вторично поражает яичник. Эндометриоидная карцинома и светлоклеточная карцинома связаны с эндометриозом яичников или таза в 15–50% случаев, ведущие исследователи предполагают, что эндометриоз является предшественником этих опухолей. В редких случаях серозная карцинома высокой степени ассоциируется с эндометриозом яичников.

Около 50% карцином яичников развиваются из уже существующих кистозных поражений, соответствуя I типу, остальные 50% развиваются в яичниках без видимых отклонений на УЗИ. Они состоят из больших масс клеток, которые часто имеют сосочковую архитектуру. Некроз - обычное явление. Опухолевые клетки имеют большие плеоморфные ядра, многие из которых многоядерные. Наблюдается высокий уровень митотической активности и часты аномальные митотические числа.

Серозные карциномы высокой степени злокачественности и аденокарциномы MMMT имеют сходные молекулярно-генетические профили. В будущем может оказаться более целесообразным включить все эти плохо дифференцированные / недифференцированные карциномы в единую категорию «анапластической карциномы».

Муцинозные опухоли (MBT) имеют некоторое сходство с серозными опухолями; 80% МВТ на поздних стадиях связаны с псевдомиксомой брюшины (PMP). Метастатические муцинозные карциномы из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, включая желчевыводящие пути, поджелудочную железу и шейку матки, могут метастазировать в яичник и имитировать первичную муцинозную опухоль яичников. Первичная MBT, в отличие от SBT, никогда не распространяются за пределы яичника.
Наиболее частым молекулярно-генетическим изменением МВТ и муцинозных карцином является точечная мутация KRAS. Возрастающая частота мутаций KRAS в кодонах 12 и 13 была описана в цистаденомах, MBT и муцинозных карциномах соответственно.

Светлоклеточная карцинома яичников ((OCCC) составляет от 10% до 15% всех случаев рака яичников. OCCC считается одним из наиболее агрессивных видов рака, поскольку он, как правило, невосприимчив к традиционным химиотерапевтическим препаратам, таким как таксол или цисплатин.
OCCC связан с повышенной экспрессией провоспалительных цитокинов, поэтому ингибирование интерлейкина-6 (IL-6) снижает пролиферацию клеток OCCC. Фактор транскрипции ядерного фактора RelA κB (NF-κB) является основным фактором, управляющим индукцией цитокинов. А цитокины участвуют во взаимодействии рака и стромы, которое может управлять процессами, вовлеченными в прогрессирование рака, такими как ангиогенез (например, IL-8) и метастазы (например, CXCL1). Отсюда ингибирование NF-κB может принести пользу лечению OCCC, блокируя прогрессирование рака.

Компоненты комплекса SWI / SNF, включая ARID1A, часто мутируют при различных типах рака. Так, ARID1A часто мутирует при OCCC и часто сосуществует с активирующими мутациями PIK3CA, который действует через путь AKT-IKK2, высвобождая RelA (путь NF-κB) из ингибитора каппа B (IκB). Мутация PIK3CA освобождает RelA от IκB, так что RelA может проникать в ядро ​​для активации генов цитокинов. Также рекрутирование репрессорного комплекса Sin3A/гистон -деацетилазы (HDAC) на гены цитокинов нарушается из-за потери ARID1A, что приводит к их дерепрессии.

Ингибитор NF-κB частично снижает пролиферацию OCCC и улучшает эффективность карбоплатина (производное цисплатина). При этом ингибирование NF-κB может избирательно подавлять рост мутантных клеток ARID1A / PIK3CA, не затрагивая при этом нормальные клетки или OCCC без этих мутаций.

Вставка

Большинство внутриклеточных белков разлагается посредством UPS, который состоит из двух этапов: убиквитинирования целевого белка и деградации протеасомой. Убиквитин-лигазы специфически распознают целевые белки и катализируют убиквитинирование, тем самым контролируя специфичность протеолиза, опосредованного UPS. Убиквитинирование само по себе представляет собой посттрансляционную модификацию белков. Сравнительные модификации представляют собой связывание убиквитин-подобных белков, таких как SUMO , Urm1 или Nedd8, соответствующих сумоилированию, Urmylierung или неддилированию.

Убиквитин - это небольшой белок; процесс маркировки белков-мишеней убиквитином называется убиквитинилированием. Несколько убиквитинов, прикрепленных в цепь, маркируют белок, таким образом полиубиквитинируемый при контроле качества белка, предназначая на деградацию в протеасоме. Само по себе убиквитинирование является многофазным процессом, три основных этапа которого катализируются различными ферментами: убиквитин-активирующий (E1), убиквитин-конъюгированный (E2) и, наконец, убиквитинлигазы (E3), которые по-разному связывают убиквитин с определенными белками-субстратами.

Ub-конъюгирующие ферменты (E2) UBE2C и UBE2S взаимодействуют с (APC / C (комплексом / циклосомой, стимулирующим анафазу Ub-лигазы E3) для регулирования клеточного цикла при раке. Повышение уровня UBE2C наблюдается при раке легких, мочевого пузыря и яичников. Фермент E2 UBE2B увеличивает полиубиквитинирование β-катенина, белка, который часто активируется в раковых клетках. Кроме того, UBE2B кооперируется с MDM2, лигазой E3 Ub, в комплексе, способствующем убиквитинированию и деградации супрессора опухоли p53.

Разнообразие целевых белков, модифицированных убиквитином, отражается в количестве различных ферментов E3. Если принять во внимание все ферменты, структурно принадлежащие к трем подсемействам ферментов E3 (HECT, RING и U-Box), для высших организмов можно принять число от нескольких сотен до одной тысячи. Здесь Е3 лигазы либо ведут себя как истинные ферменты (HECT E3s), либо занимаюися «сватовством» (RING E3s).
Так, RING finger E3 ubiquitin ligase RNF146 (также известная как Iduna) отвечает за PARylation-зависимое убиквитинирование AXIN, тем самым положительно регулируя передачу сигналов Wnt. Здесь PAR (поли (АДФ-рибоза) функционирует как «молекулярный переключатель» для изменения аллостерической конформации RNF146 и активации его лигазной активности для убиквитинирования и деградации целевых белков.

С другой стороны, существует ряд различных десубиквитинирующих ферментов (DUB), под действием которых, помимо прочего, присоединенные молекулы убиквитина могут быть снова удалены. DUB представляют собой протеазы, состоящие из пяти подсемейств, включая убиквитинкар -боксиконцевые гидролазы (UCH), убиквитинспецифические протеазы (USP), опухолевые протеазы яичников (OTU), металлопротеазы JAMM / MPN и протеазы болезни Мачадо-Якоба (MJD). Все DUB представляют собой цистеиновые протеазы, кроме металлопротеаз JAMM / MPN 6 .

Убиквитин имеет глобулярную форму, выступают только последние четыре С- концевые аминокислоты. Важными функциональными аминокислотами являются C- концевой глицин (G) в 76-м положении (G76) и лизины (K) в 48-м (K48) и 63-м положении (K63) аминокислот -ной последовательности. Через C- концевую карбоксильную группу на G76 убиквитин ковалентно связывается со специфическими лизинами, цистеинами, серинами, треонинами или N- концом маркируемого белка . Дополнительные молекулы убиквитина могут быть присоединены к уже связанному убиквитину через лизины, так что образуется цепь убиквитина. Поскольку убиквитин содержит всего семь лизинов, возможны по крайней мере семь различных типов соединения убиквитина.

Если по крайней мере пять молекул убиквитина связаны в цепь с целевым белком, это называется полиубиквитинизацией. Если эти молекулы связаны друг с другом по лизину 48 (K48), целевой белок в основном расщепляется протеасомой . Соединение по лизину 63 (K63) может привести к лизосомной деградации белка или активировать киназы.Здесь K63 и линейные цепи убиквитина играют роль каркаса для сигнальных сборок и играют важную роль во многих биологических процессах, включая воспаление.

С другой стороны, моно- и мультиубиквитинации меньше влияют на стабильность отдельных белков, чем на их внутриклеточное распределение, и могут обеспечивать взаимодействие с другими белками. Олигоубиквитинирование, например, влияет на активность фактора транскрипции, не инициируя его деградацию. Моноубиквитинирование играет преобладающую роль в транспортировке белков, в то время как полиубиквитинирование способствует транспортировке белков (через K63) и деградации (через K48).

Система убиквитиновых протеасом играет важную роль в «обеспечении качества» внутриклеточно продуцируемых белков. Белки должны быть правильно сложены во время и после их производства, чтобы они функционировали. Особые белки - шапероны могут способствовать правильному сворачиванию белка. В случае «непоправимого» неправильного свертывания образуется комплекс белок-шаперон-убиквитин-E3-лигаза, который полиубиквитинирует неправильно свернутый белок и, таким образом, делает возможной деградацию протеасомой. Таким образом гарантируется, что структурно вырожденные белки ни цитозольные, ни мембранно- связанные, не влияют на клеточные процессы.

Убиквитин участвует во внутриклеточной передаче сигнала внешних стимулов, например, в сигнальном пути NF-kB ( англ. Nuclear factor kappa B). Он может быть активирован сигнальной молекулой фактора некроза опухоли (TNF). Если TNF связывается с рецептором TNF клеточной мембраны, E3-лигаза TRAF2 рекрутируется во внутриклеточную часть рецептора путем его конформационного изменения . Она полиубиквитинирует себя и белок RIP через связи K63.
Убиквитинированные белки RIP и TRAF2 продуцируют разные киназы, фосфорилирующие ферменты. Киназа βIκ в конечном итоге фосфорилирует белок IκB, что освобождает ранее связанный и неактивный NF-κB. NF-κB мигрирует в ядро клетки и активирует там транскрипцию определенных генов. IkB, с другой стороны, полиубиквитинируется через K48 и разлагается через протеасомы.

Ингибиторы протеасом были первоначально разработаны для лечения кахексии, которая возникает у пациентов с запущенными формами рака и характеризуется катаболическим состоянием, которое приводит к прогрессирующему истощению. В настоящее время существует два ингибитора протеасом, одобренных FDA, бортезомиб (Velcade), пептид боронат, и карфилзомиб (Kyprolis), пептид-эпоксикетон.

Лечение бортезомибом приводит к стабилизации I-κB, важного супрессора передачи сигналов NF-κB. Кроме того, бортезомиб также вызывает накопление двух важных негативных регуляторов клеточного цикла, p27 KIP1 и p53, оба из которых являются важными супрессорами опухолей. Другим потенциальным преимуществом лечения бортезомибом может быть накопление проапоптотического белка BAX, тем самым смещая баланс в сторону апоптоза. И последнее, но не менее важное: бортезомиб также вызывает стресс эндоплазматического ретикулума и окислительный стресс в раковых клетках, что может ускорить апоптоз.

Карфилзомиб блокирует доступ субстратных белков к каталитическим остаткам. Карфилзомиб необратимо подавляет протеасомную активность до уровня менее 20%, поэтому единственный способ восстановить протеасомную активность - это заново синтезированные и собранные протеасомы. Следовательно, карфилзомиб более эффективен, чем бортезо -миб, вызывая ответы, например, при устойчивой к бортезомибу множественной миеломе.

При раке груди широко используются антагонисты ER, прежде всего тамоксифен, вместе с ингмбмторами ароматазы. Но в конечном итоге сопротивление эндокринной терапии почти неизбежно. Секвенирование рецепторов показало , что точечные мутации в ESR1 являются драйверами для устойчивости к существующим терапии.
Кроме того, антагонисты ER могут обладать агонистическими свойствами в определенных тканях, таких как матка, что затрудняет их использование. Поэтому неудивительно, что существует значительный интерес к разработке селективных подавляющих регуляторов ER (SERDs) для нацеливания на ER для деградации. В настоящее время фулвестрант, антиэстроген с чистой антагонистической активностью, является единственной молекулой SERD, одобренной для лечения рака груди. Однако плохие фармацевтические свойства этого инъекционного препарата и отсутствие его превосходства над ингибиторами ароматазы второй линии при поздней стадии рака груди отрицательно повлияли на его клиническое применение.

Элацестрант - это новый нестероидный пероральный биодоступный селективный деструктор эстрогеновых рецепторов (SERD), который продемонстрировал активность у пациентов с эстроген-положительным / HER2-отрицательным раком груди, ранее получавшим эндокринную терапию, включая фулвестрант и / или CDK 4/6 ингибитор терапии, а также у больных с ESR1 мутаций ( ESR1-mut), что, как известно, придает эндокринную резистентность.

Базедоксифен (BZA) - мощный пероральный антиэстроген, который клинически одобрен для использования в заместительной гормональной терапии (DUAVEE). Он показал сильные антагонистические профили и профили SERD в груди, сохраняя при этом полезные агонистические свойства в кости и не стимулировал ткань эндометрия в доклинических исследованиях.

Продолжим.

Помимо убиквитина, у млекопитающих существует более дюжины убиквитин-подобных молекул (Ubls), которые все активируются эквивалентным ферментативным каскадом для конъюгации со своими родственными субстратами. Один из этих путей конъюгации с Ubl включает NEDD8, молекулу Ubl, которая имеет примерно 60% сходства последовательностей с убиквитином. Как и убиквитинирование, неддилированные субстраты, в частности кулины - регуляторный каркас мультисубъединичных E3-лигаз - играют критическую роль в пролиферации клеток.

Подобно убиквитинированию, конъюгация зрелого NEDD8 с белками-мишенями осуществляется мультиферментным каскадом E1-E2-E3. Зрелый NEDD8 конъюгируется с белками-мишенями АТФ-зависимым образом посредством последовательных реакций, катализируемых последовательно E1 (NAE), E2 (Ubc12) и E3. С помощью этих ферментов C-концевой глицин NEDD8 образует изопептидную связь с лизином целевого белка. Денеддилазы, такие как CSN и NEDP1, деконъюгируют NEDD8 из недилированных белков перед протеосо -мой, захватывающей высвобождающийся субстрат.

NAE - единственный специализированный NEDD8 E1, но помимо NAE, фермент, активирующий убиквитин E1, UBE1 также может функционировать как атипичный NEDD8 E1, опосредуя присоединение NEDD8 к цепи убиквитина. Другие убиквитин-лигазы, такие как MDM2, c-Cbl, паркин и IAP, также могут функционировать как лигазы E3 NEDD8, способствуя неддилированию различных клеточных белков.

Основными известными субстратами модификации NEDD8 являются Cullin - субъединицы убиквитинлигаз E3 на основе Cullin, которые активны только при неддилировании. Их NEDDylation является критическим для рекрутирования E2 в лигазный комплекс, тем самым облегчая конъюгацию убиквитина, то есть NEDD8 является модулятором процесса убиквитинирования. Путь NEDD8, по-видимому, влияет на функцию UPS, по крайней мере, посредством регулирования активности убиквитинлигазы, антагонизма убиквитинированию или контроля удлинения убиквитиновой цепи.

Неддилирование регулирует активность CRL, самого большого известного класса убиквитинлигаз. CRL состоит из каркасного белка cullin, белка RING Rbx1, который рекрутирует убиквитин E2, адаптивного белка Skp1, который взаимодействует с белком F-бокса, и самого F-бокса, распознающего субстрат. Сочетая индивидуальный кулин (всего их 7 видов) с различными белками F-бокса, CRL контролируют деградацию огромного количества клеточных белков и, что неудивительно, участвуют во многих аспектах биологических процессов.

CRLs составляют ~ 20% всей протеасомной деградации в клетке, а многие CRL-белки связаны с опухолевым генезом. Так, при апоптозе комплекс, образующийся после активации рецепторов смерти TRAIL-R1 / R2 (DR4 / DR5), называется сигнальным комплексом, индуцирующим смерть (DISC), состоящим из рецепторов, адапторной молекулы FADD, прокаспазы-8 и FLIP. FADD рекрутирует прокаспазу-8 в этот комплекс, где она образует гетеродимер с длинной формой FLIP (L)), регулирующей ее процессинг и активность .

Cullin-3 взаимодействуя с TRAIL-R2 DISC, способствует K63-связанному убиквитинированию p10-субъединицы каспазы-8, что усиливает ее ферментативную активность и индукцию апоптоза. Связь p43-FLIP (L) с TRAIL-R2 DISC усиливает его взаимодействие с SCF Skp2 (см. ниже), что приводит к нацеливанию p43-FLIP (L) на протеасомы и снижение уровней гетеродимера FLIP (L): каспаза-8. Так возникает конкуренции между SCF Skp2 и каноничес -кимии белками DISC за связывание p43-FLIP (L). Таким образом Cullin-1 регулирует DISC главным образом посредством модуляции FLIP (L).

Недилирование кулинов запускает сборку функциональных CRL, приближает заряженный убиквитином E2 и субстрат и способствует переносу убиквитина к субстратам. После завершения убиквитинирования CSN делает возможным денеддилирование кулинов, что приводит к разборке CRL и высвобождению убиквитина E2 для следующего раунда убиквитинирования.

Такие Е3 лигазы, как Mdm2, Рarkin и Smurf1, также могут быть модифицированы с помощью NEDD8, и такая модификация влияет на их убиквитинлигазную активность. Например, Smurf1 представляет собой убиквитинлигазу HECT, неддилирование которого усиливает его ассоциацию с убиквитин E2, что играет решающую роль во многих процессах, включая развитие клеточного цикла, пролиферацию клеток, дифференцировку, поддержание стабильности генома и метастазирование. Так, при колоректальном раке человека повышенная экспрессия Smurf1, NEDD8, NAE1 и Ubc12 коррелирует с прогрессированием рака.

Показано также, что неддилирование ряда клеточных белков, таких как PINK1, HuR и RCAN1, противодействует убиквитинированию и увеличивает их стабильность. Например, HuR представляет собой РНК-связывающий белок, который регулирует пролиферацию и выживаемость клеток. HuR модифицируется NEDD8 по его лизинам 283, 313 и 326, что опосредуется NEDD8 E3 лигазой Mdm2. Неддилирование HuR подавляет его убиквитинирование, увеличивает его стабильность и способствует его ядерной локализации.

Также возможно, что при (протеотоксическом) стрессе, NEDD8 функционирует как заменитель убиквитина и блокирует убиквитиновую цепь, таким образом предотвращая чрезмерное удлинение убиквитиновой цепи и истощение пула убиквитина, что в противном случае было бы катастрофично для клеток.

Активированный NEDD8 необходим в двух путях репарации ДНК: NER и NHEJ, при этом накопление NEDD8 в сайтах повреждения ДНК является очень динамичным процессом. Неддилирование необходимо в течение короткого периода суб-пути глобальной репарации генома (GGR) - эксцизионной репарации ДНК (NER). В GGR NER после того, как повреждение ДНК вызвано УФ-облучением, Cul4A в комплексе белка 2 связывания повреждений ДНК ( DDB2 ) активируется NEDD8, и это позволяет GGR-NER приступить к устранению поврежде -ния.

Неддилирование также играет роль в восстановлении двухцепочечных разрывов. Негомологичное соединение концов (NHEJ) - это путь репарации ДНК, часто используемый для репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Первый шаг на этом пути зависит от гетероди -мера Ku70 / Ku80, который образует высокостабильную кольцевую структуру, охватыва -ющую концы ДНК. Но гетеродимер Ku должен быть удален, когда NHEJ завершается, иначе он блокирует транскрипцию или репликацию. Он убиквитилируется, чтобы способствовать высвобождению Ku и других факторов NHEJ из сайта репарации после завершения процесса.

Если активация NEDD8 ингибируется, клетки с индуцированным дефицитом NER или NHEJ могут погибнуть из-за недостаточной репарации ДНК, приводящей к накоплению повреж -дений ДНК. Эффект ингибирования NEDD8 может быть больше для раковых клеток, чем для нормальных клеток, так как они более активны в альтернативных путях репарации ДНК (см.выше). Ингибитор NAE, MLN4924 (певонедистат) индуцирует гибель клеток из-за неконтролируемого синтеза ДНК во время S-фазы клеточного цикла, приводя к повреждению ДНК и индукции апоптоза. MLN4924 взаимодействует с сайтом связывания нуклеотидов в NAE и образует ковалентный аддукт, который имитирует NEDD8-AMP, но не может участвовать в последующих реакциях, что приводит к блокированию функции NAE.

F-box белок SKP2 образует комплекс с CUL1, SKP1 и белком RING-пальца RBX1, вместе называемый SCF SKP2. SKP2 был впервые идентифицирован как критический регулятор клеточного цикла, потому что он убиквитинирует несколько важных регуляторов клеточного цикла, включая p27 KIP1 и p21 CIP1 , оба являются критическими ингибиторами CDK. SKP2 также играет критическую роль в EGFR-обеспечиваемом убиквитинировании AKT и рекрутировании мембран. Онкогенный потенциал SKP2 был предложен его избыточной экспрессией в различном злокачественных опухолях человека. Важно отметить, что эта сверхэкспрессия SKP2 показала обратную связь с p27 KIP1. Более того, уровни белка SKP2 могут служить прогностическим биомаркером, с более высокими уровнями, предсказывающими плохую выживаемость пациентов.

Cинтетический сompaund 25 нарушает взаимодействие между SKP1-SKP2 и, таким образом, отменяет активность лигазы SCF SKP2 . Он синергетически взаимодействуя с химиотерапевтическими агентами снижает выживаемость опухоли.

Мультидоменный связывающий белок 6 ретинобластомы (RBBP6) принадлежит к особому семейству эукариот и отсутствует у прокариот. Молекулярные функции RBBP6 включают метаболизм нуклеиновых кислот (репликацию, транскрипцию и сплайсинг пре-мРНК), активность убиквитинлигазы E3 и взаимодействие с p53 и белком ретинобластомы (RB1).

Белок контрольной точки сборки митотического веретена (MAD2L2) взаимодействует с RBBP6; он контролирует контрольную точку митоза. Он действует в комплексе с другими белками, чтобы напрямую ингибировать Cdc20, не позволяя ему активировать комплекс, способствующий анафазе (APC), убиквитинлигазу, которая важна для инициации сегрегации хромосом. Это означает, что RBBP6 действует на решающем этапе, когда сегрегация хромосом происходит в митозе и в мейозе. В противном случае может возникнуть анеуплоидия.

RBBP6 также обнаруживается в областях прикрепления ядерного матрикса (MAR), что указывает на участие в организации хроматина, где он рекрутирует p53 и Rb, а также член серин-аргининового подсемейства протеинкиназ, известных как SRPK1a, и факторы прикрепления матрикса, SAF-B и нуклеолин. Эти особенности дополнительно усиливают роль RBBP6 в организации хроматина.

RBBP6 экспрессируется на ранних стадиях развития человека и идентифицируется как «тот, кто рано встает»: он легко обнаруживается в ооците и сильно активируется на стадиях 2-8 клеток. RBBP6 также является одним из белков с более чем трехкратной экспрессией в плюрипотентной РНК эмбриональных стволовых клеток человека.

Продолжим.

Ген RBBP6 имеет 17 интронов, которые альтернативно сплайсируются для получения четырех транскриптов: разные изоформы RBBP6 обладают уникальными функциями. Так, изоформа 3 представляет собой регулятор клеточного цикла, необходимый для контрольной точки G2 / M, и обладает антипролиферативным действием, поскольку его сверхэкспрессия стабилизирует p53 и подавляет рост (в отличие от изоформы 1). Изоформа 3 не регулируется в опухолях, но обильно экспрессируется в нормальной ткани, ассоциированной с опухолью.

Сам p53 контролирует обе фазы G1 / S и G2 / M, поскольку его транскрипционная мишень, p21, ингибирует циклинзависимые киназы в контрольных точках G1 / S, а также киназу cdc2 в G2 / M. PRb, с другой стороны, является ключевым регулятором границы G2 / M, и его истощение приводит к остановке G2.

Путь, необходимый для репликации и стабильности генома человека, состоит из трех компонентов: убиквитинлигазы E3, репрессора транскрипции и белка репликации. Убиквитинлигаза Е3 RBBP6 убиквитинирует и дестабилизирует репрессор транскрипции ZBTB38. Этот репрессор отрицательно регулирует транскрипцию и уровни фактора репликации MCM10 на хроматине.

RBBP6 регулирует репликацию генома и стабильность CFS, поскольку в его отсутствие репликация ДНК замедляется, и CFS теряются из генома. Репликационный белок MCM10 является прямой мишенью репрессии транскрипции с помощью ZBTB38, и его подавление отвечает за нарушения репликации, которые возникают в отсутствие RBBP6. Эти данные предоставляют доказательства решающей роли оси RBBP6 / ZBTB38 / MCM10 в сохранении и стабильности генома.

Репликация ДНК - это период, в течение которого геном особенно уязвим. Среди областей, которые очень чувствительны к аномалиям репликации, есть общие ломкие сайты (CFS) - участки генома, склонные к разрыву ингибиторами репликации (внешний стресс репликации). Так, вызванный онкогенами репликационный стресс (RS) вызывает повреждение ДНК в CFS на самых ранних стадиях рака.

Геномные изменения чаще встречались в CFS при эпидермальных и уротелиальных предопухолевых поражениях, а также при раке. CFS были в среднем менее гибкими, чем нехрупкие области, содержали больше последовательностей гуанин-цитозин (GC) и Alu. Отметим, что элементы Alu имеют тенденцию отдавать предпочтение GC- островкам и областям, богатым генами. Регионы с потерей гетерозиготности были также менее гибкими и имели более высокий процент Alu.

Большинство транслокаций, связанных с раком, содержат точки останова в CFS, и многие гены, которые были идентифицированы как опухолевые супрессоры или онкогены, расположены в CFS, решительно подтверждая, что хрупкость СХУ причинно способствует развитию рака.

Повреждения CFS могут иметь далеко идущие последствия, если они могут инициировать цикл теломерного разрушения-слияния-разрушения. При таком сценарии может быть создан порочный круг прогрессирующего ухудшения хромосомной нестабильности. С другой стороны их раннее вовлечение может служить для усиления клеточного ответа на потенциальную геномную угрозу, как ранний сенсор избыточного RS. В этом случае разрывы в этих местах могут функционировать как «система сигнализации», вызывающая быстрый защитный отклик в нормальных условиях, когда механизм ответа на повреждение ДНК не поврежден.

Супрессор опухолей р53 играет ключевую роль в защите от рака. В физиологических условиях вновь синтезированный р53 быстро подвергается убиквитинированию и деградации, что приводит к «бесполезному циклу» и очень низкому «устойчивому» уровню белка. Это в значительной степени контролируется лигазой RING finger E3, MDM2 (Mouse double minute 2 homolog, HDM2 у человека). Помимо того, что MDM2 является ингибитором транскрипции p53, он также тесно взаимодействует с самим белком p53, узнавая N-концевой домен трансактивации (TAD), позволяя p53 подвергаться убиквитинированию и последующей протеасомной деградации. Mdm2 подвергается ускоренной деградации на ранней стадии повреждения ДНК, тем самым вызывая быструю стабилизацию и активацию p53.

В дополнение к активности транс-E3-лигазы в отношении p53, Mdm2 также опосредует собственное разложение посредством автокаталитического механизма. В стрессовых условиях, таких как повреждение ДНК, Mdm2 подвергается ATM -опосредованному фосфорилированию и последующей деградации, тем самым запуская стабилизацию и активацию p53. Mdm2 стабилизируется структурно родственным белком Mdmx и его сплайсированными формами. Также E3 лигаза NEDD4-1 увеличивает стабильность Mdm2 за счет стимулирования его полиубиквитинирования, связанного с Lys 63. Но деубиквитинирующий фермент HAUSP способен стабилизировать Mdm2 посредством удаления его полиубиквитиновых цепей.

Как негативный регулятор p53, MDM2 сверхэкспрессируется при многих раках либо за счет амплификации гена, либо за счет усиления транскрипции. Так, Mdm2 часто сверхэкспрессируется при остром лимфобластном лейкозе у детей с помощью пост-транскрипционных механизмов. Среди всех малых молекул, которые ингибируют MDM2, Nutlins, семейство аналогов цис-имидазолина, выявленных с помощью высокопроизводительного скрининга, обладает наибольшим потенциалом и в настоящее время проходит клинические испытания. Обработка Nutlin индуцировала накопление дикого типа, но не мутантного белка p53, так как большинство мутантов p53 больше не подвергаются убиквитинированию с помощью MDM2 и становятся стабилизированными.

Отметим, что молекулы, нацеленные на восстановление нативной конформации мутантов p53 и реактивацию их опухолевой супрессорной функции, могут принести больше пользы при более широком спектре рака. Например: PRIMA-1 и его аналог APR-2 ковалентно модифицируют мутанты p53 посредством алкилирования тиоловых групп, восстанавливая конформацию дикого типа и функцию мутантного p53.

Стабилизация p53 после ионизирующего излучения является результатом ингибирования связывания MDM2 через каскад фосфорилирования, который сначала требует фосфорилирования p53 S15, что необходимо для последующего фосфорилирования T18.

В прошлом считалось , что цитоплазма является эксклюзивным местом деградации р53, таким образом , ядерный экспорт р53 является необходимым условием для его доставки в цитоплазматический протеас. После признания того, что сам p53 обладает сигналами ядерного экспорта (NES), самотранспортный p53 также был включен в модель. Позже было обнаружено, что домен пальца MDM2 RING, но не NES MDM2, необходим как предпосылка для эффективного экспорта p53 в цитоплазму. MDM2 моноубиквитинирует все доступные остатки лизина на COOH-конце p53, тем самым выявляя NES в соседнем домене тетрамеризации и позволяя взаимодействовать с экспортным рецептором CRM1.

Ядро ​​также является физиологическим местом деградации p53. Важно отметить, что 26S протеасомы в равной степени находятся в изобилии в цитозоле и ядра. Более того, убиквитинирование p53 - предварительное условие его деградации - явно происходит в ядре, и фактически ядро, вероятно, является единственным местом для этой модификации. Таким образом, в нелетальных исходах клеточного стресса, когда повреждение ДНК было успешно восстановлено и активный ответ p53 необходимо быстро подавить для восстановления нормального гомеостаза, задействуются как ядерные, так и цитоплазматические протеасомы для эффективного разрушения повышенного уровня p53 и MDM2. уровни белка. Локальная ядерная деструкция добавляет более жесткий контроль и ускоряет выключение пути p53.

Разные активаторы ответа контрольной точки p53 нацелены на путь деградации MDM2. Ионизирующее излучение действует через каскад так называемый стресс - киназы, с сигнала АТМ киназы к контрольной точке киназ hCHK1 и hCHK2 с целью фосфорилировать p53 в несколько NH 2 концевых остатков серина. Фосфорилирование Thr18 также может быть регуляторным механизмом, который разрушает комплекс p53-MDM2, таким образом активируя p53 в ответ на повреждение ДНК.Общий эффект этих модификаций может заключаться в снижении аффинности комплексов p53-MDM2.

Напротив, как УФ-излучение, так и гипоксия снижают уровни транскриптов и белка MDM2, тем самым снижая деградацию p53. Более того, УФ-повреждение блокирует убиквитинирование и вместо этого способствует сумоилированию p53 на Lys386, что способствует его транскрипционной активности. Впрочем, сам белок MDM2 стал центром внимания и теперь также признан основной мишенью сигналов, которые приводят к стабилизации p53. MDM2 подвергается многосайтовому фосфорилированию in vivo, при этом большинство сайтов модификации сгруппированы в пределах p53-связывающего домена и центрального кислотного домена, необходимого для деградации p53.

Продолжим.

Важность p53 в подавлении опухоли неоспорима, о чем свидетельствует его инактивация более чем в половине всех спорадических случаев рака человека. Во время развития опухоли TP53 мутация, спорадическая или наследуемая, обычно сопровождается потерей гетерозиготности, что приводит к дефициту p53. Кроме того, p53 является членом мультибелкового семейства факторов транскрипции, в которое также входят p63 и p73, и эти факторы выполняют как перекрывающиеся, так и различные клеточные роли.

Большинство мутаций TP53, обнаруженных в опухолях человека, представляют собой миссенс-мутации (80%), которые находятся в ДНК-связывающем домене (DBD), чаще всего в шести «горячих точках». Эти мутации подразделяются на контактные мутации, которые изменяют остатки, которые имеют решающее значение для взаимодействия с ДНК, и структурные мутации, которые нарушают трехмерную укладку DBD.

Мутантный p53 не только оказывает доминантно-негативный эффект на белок дикого типа, но также проявляет свойства увеличения функции (GOF). Мутантный p53 может проявлять эффекты GOF посредством регуляции транскрипции, взаимодействуя с различными другими факторами транскрипции, такими как ядерный фактор Y (NFY), рецептор витамина D (VDR), p63 и p73. Специфические клеточные ответы p53 зависят от функции p53 как активатора транскрипции и от p53-опосредованной индукции определенных генов-мишеней.

p53 - это сенсор клеточного стресса, который вызывает временную остановку клеточного цикла, постоянную остановку клеточного цикла (клеточное старение) и апоптоз в ответ на множество различных стрессов, включая повреждение ДНК, гиперпролиферативные сигналы, гипоксию, окислительный стресс, истощение рибонуклеотидов и нехватка питательных веществ. В ответ на такие стрессовые сигналы р53 вытесняется из своих негативных регуляторов MDM2 и MDM4, тем самым обеспечивая его стабилизацию и активацию.

Наиболее хорошо проработанными молекулярными моделями активации р53 являются модели в ответ на сигналы острого повреждения ДНК и гиперпролиферативные сигналы. Индукция p53 в результате острого повреждения ДНК начинается, когда двухцепочечные разрывы ДНК запускают активацию мутированной серин/треонин протеинкиназы, известной как ataxia telangiectasia and Rad3-related protein (ATR) или FRAP-related protein 1 (FRP1) - киназы, которая фосфорилирует киназу CHK2, или когда застопорившиеся или свернутые вилки репликации ДНК рекрутируют ATR, который фосфорилирует CHK1.

ATR участвует в распознавании повреждения ДНК и активации контрольной точки повреждения ДНК, что приводит к остановке клеточного цикла. ATR активируется в ответ на стойкую одноцепочечную ДНК, которая является обычным промежуточным звеном, образующимся при обнаружении и репарации повреждений ДНК. Одноцепочечная ДНК встречается в остановившихся ответвлениях репликации и в качестве промежуточного звена в путях репарации ДНК, таких как эксцизионная репарация нуклеотидов и ремонт путем гомологичной рекомбинации. ATR относится ко второй киназе, активирующей контрольные точки, наряду с ATM , которая активируется двухцепочечными разрывами ДНК или разрушением хроматина (см. выше).

ATR работает с белком-партнером, называемым ATRIP, для распознавания одноцепочечной ДНК, покрытой RPA. Белок репликации А ( RPA ) является основным белком, который связывается с одноцепочечной ДНК (ssDNA) в эукариотических клетках. Во время репликации ДНК RPA предотвращает наматывание одноцепочечной ДНК на себя или образование вторичных структур. Это заставляет ДНК раскручиваться, чтобы полимераза могла ее воспроизвести. РПА также связывается с ssDNA во время начальной фазы гомологичной рекомбинации , что является важным в процессе репарации ДНК и профазы I из мейоза.
После активации ATR фосфорилирует Chk1 , инициируя каскад передачи сигнала , кульминацией которого является остановка клеточного цикла. В дополнение к своей роли в активации контрольной точки повреждения ДНК, ATR, как полагают, участвует в невозмущенной репликации ДНК.

Опухолевые клетки in vivo вероятно, чаще сталкиваются с более хроническим повреждением ДНК низкого уровня из-за стресса репликации, истощения теломер или окислительного повреждения, что может способствовать подавлению опухоли через пути p53, отличные от путей, необходимых для передачи сигналов острого повреждения ДНК. Так, OIS (онкоген-индуцированное старение) может активировать p53, минуя DDR: Ras через NOREA1, который способствует ацетилированию р53 при старении, ингибируя его проапоптотическое фосфорилирование, AKT, посредством подавления MnSOD, истощения онкосупрессора PTEN , индуцируя связывание mTORC1 и mTORC2 с p53 вместо MDM2, и MAPK p38γ посредством прямого фосфорилирования p53.

p53 является субстратом как для киназ ATM, так и для ATR, а также для CHK1 и CHK2, которые координированно фосфорилируют (P) p53, способствуя его стабилизации. Фосфорилирование p53 происходит по нескольким сайтам, особенно по аминоконцу, например по серинам 15 и 20. Эти события фосфорилирования играют важную роль в стабилизации р53, так как некоторые из модификаций нарушают взаимодействие между р53 и его негативными регуляторами MDM2 и MDM4.

Гиперпролиферативные сигналы аналогичным образом активируют p53 посредством нарушения взаимодействия MDM2-p53. Эти сигналы могут функционировать путем высвобождения фактора транскрипции E2F, который может стимулировать транскрипцию опухолевого супрессора ARF. ARF в свою очередь, ингибирует MDM2 своей антагонистической активностью и / или запирая MDM2 в ядрышках.

В модели р53 как «хранителя генома» р53 работает как триггер ареста G1 в ответ на повреждение ДНК путем трансактивации CDKN1A. Помимо способности p53 полностью блокировать развитие клеточного цикла в ответ на сигнал стресса, базальные уровни p53 могут также просто замедлять скорость прохождения клеточного цикла.

Ингибирование метаболического перепрограммирования с помощью p53 может препятствовать онкогенезу за счет ограничения пролиферации или активации апоптоза, а индукция аутофагии также может подавлять рак, облегчая апоптоз. Точно так же классические ответы могут влиять на новые функции, напр., P53-индуцированное старение ускоряет передачу сигналов в микроокружение опухоли, что в конечном итоге провоцирует супрессию опухоли.

Более 80% мутаций TP53 в опухолях человека локализуются в ДНК-связывающем домене и нарушают специфичное для опухоли связывание ДНК. Карбоксиконцевой домен тетрамеризации, через который мономеры p53 взаимодействуют с образованием тетрамеров, также важен для активации транскрипции.

Клеточное старение связано с опосредованным p53 подавлением опухоли в определенных контекстах и появлением маркеров старения. Наиболее изученными путями, участвующими в регуляции клеточного старения, являются пути опухолевых супрессоров p53 / p21 cip1 и / или p16 INK4A / Rb. Так, различные внутренние или внешние стрессовые факторы запускают путь ответа на повреждение ДНК (DDR), который, в свою очередь, активирует пути p53 и / или p16 INK4A. p16 INK4A инактивирует Cdk4 / 6, что приводит к накоплению фосфорили -рованного pRb, останавливает регуляцию факторов транскрипции E2F и запускает остановку клеточного цикла или старение. Эти стрессоры также сами вызывают повреждение ДНК (клеточные ответы на такие повреждения регулируются путями ATM-Chk2 или ATR-Chk1) и трансактивируют p53 и p21 CIP1 . Более того, уровни белка p21 CIP1 могут приводить к ингибированию активности Cdk4 / 6, что способствует остановке на G1 или старению.

После активации p21 cip1 выполняет множество функций, включая его роль в обеспечении модуляции экспрессии генов многих мишеней p53, таких как CDC25C, CDC25B и сурвивин, в основном за счет рекрутирования комплекса E2F4. Однако решающее значение p21 cip1 зависит от его способности стимулировать старение через ингибирование апоптоза; было доказано, что он связывает многие агенты апоптоза, включая многие каспазы. Это согласуется с доказательствами обратной связи между апоптозом и уровнями p21 cip1; в клетках колоректального рака в ответ на высокие уровни доксорубицина p53 ингибирует экспрессию p21 cip1 через DNMT3a.

Кроме того, Δ40p53, Δ133p53α и p53β представляют собой изоформы p53, которые в основном участвуют в клеточном старении, особенно на его ранних стадиях. Δ133p53α, в большом количестве накапливаясь в пролиферирующих клетках, противодействует функциям p53, в то же время уровни p53β низкие. В стареющих клетках p53β активируется посредством сплайсинга, опосредованного SRSF3, а Δ133p53α подавляется посредством аутофагической деградации, опосредованной STUB1. Более того, Δ40p53, по-видимому, регулирует клеточное старение, действуя двумя разными способами: напрямую регулируя сигнальный путь IGF-1 для модуляции факторов роста и выживания клеток и регулируя транскрипционную активность полноразмерного p53 на гене-мишени посредством прямого связывания.

Продолжим.

В то время как путь p53 / p21 cip1, по- видимому, играет ключевую роль в инициации старения, путь с участием p16 и семейства белков ретинобластомы (семейство Rb), по-видимому, играет центральную роль в поддержании клеточного старения. Об этом свидетельствовало снижение уровня p53 после индукции старения, в то время как уровень p16 оставался стабильно высоким. Впрочем, например, когда p53 и pRb одновременно восстанавливались до нормальных уровней в клетках карциномы шейки матки человека, клеточное старение индуцировалось почти во всех клетках.

Вообще, активация пути p16 может быть ответственна за проведение границы между двумя различными фазами старения: ранней, обратимой фазой, в которой доминирует активность p53, и необратимой фазой, индуцированной путем p16 / Rb.
Путь p16 может включать различные белки, принадлежащие к семейству Rb, а именно pRb / p105, p107 и pRb / p130. В прогрессировании старения в клетках человека, по-видимому, основная роль принадлежит Rb2 / p130 посредством репрессии циклина А, при этом классический Rb участвует только на ранних этапах.

Отметим, что INK4a / ARF локус кодирует два критических опухолевых супрессоров, p16INK4 и ARF, которые, в дополнение к их роли в раке, являются важными индукторами клеточного старения. Несмотря на общие экзоны, два белка кодируются в разных рамках считывания, и, как следствие, они не имеют гомологии аминокислот и обладают разными молекулярными функциями. В то время как p16INK4a является ингибитором циклин-зависимых киназ CDK4 и CDK6 (см. выше) и действует путем остановки клеточного цикла на G1, ARF регулирует стабильность p53 посредством инактивации MDM2.
INK4a / АРФ локус, как правило , малоактивен в большинстве тканей у молодых организмов, но активируется со старением. Эпигенетические регуляторы семейства Polycomb ответственны, по крайней мере частично, за низкие уровни экспрессии p16INK4a и ARF в нормальных условиях в молодых тканях.

Существует модель, в которой клетки обладают по крайней мере двумя независимыми часами: один зависит от теломер и в основном регистрирует накопленное число клеточных делений; другие часы зависят от INK4a / ARF и в основном регистрируют воздействие на клетки митогенной стимуляции.

Характерные изменения стареющих клеток включают уплощенную и увеличенную форму клеток, увеличенный лизосомный компартмент и вакуоли, повышенную скорость метаболизма и продукцию активных форм кислорода (АФК),формирование ассоциированного со старением секреторного фенотипа (SASP), ядерные изменения и изменения хроматина, а также устойчивость к апоптотическим стимулам. Так, старение также характеризуется секрецией набора цитокинов и хемокинов, известных как секреторный фенотип, связанный со старением (SASP), а также конститутивно активным NF-kB. В этом отношении было показано, что SASP способствует воспалению.

Следовательно, p53 может действовать как рестриктор и аттенюатор (ступенчатое снижение) воспалительных реакций за счет баланса между p53 и NF-kB.

Динамичное развитие клеточного старения:
1. Первичное старение - индукция пути p53 / p21, индукция антипролиферативной транс -крипционной программы (маркеры BAF57, GADD45 NOTCH1).
2. Развитие старения - путь p53 / p21 и / или p16, высвобождение SASP, морфологические изменения (маркеры п21, п19, п16, LIMA1, Ki-67).
3. Позднее старение - избыточная продукция SASP, ремоделирование хроматина, лизосомная активность, путь p16 (маркеры Il-6, PGC-1β, SA-бета-галактозидаза IFN-I, Ki-67).

Через секрецию SASP стареющие клетки могут влиять на окружающие клетки в различных микросредах. В этом контексте тканеспецифические различия могут влиять на различную экспрессию p53, способствуя определению судьбы клеток после воздействия генотоксического стресса.
Стареющие клетки и SASP могут направлять и способствовать миграции / инвазии раковых клеток в моделях рака щитовидной железы и кожи. Инвазия и метастазирование опухоли также включают нарушение базальной мембраны и ремоделирование ВКМ матриксными металлопротеиназами (ММП), которые часто выражаются как факторы SASP. Хотя старение является барьером для перепрограммирования, паракринная активность стареющих клеток может способствовать экспрессии маркеров стволовых клеток и пролиферации соседних клеток, и IL6 играет ключевую роль в управлении этим процессом.
В целом, стареющие клетки посредством своего SASP могут индуцировать недифференцированные клеточные состояния; в зависимости от контекста это может быть полезным (например, регенерация ткани) или вредным (например, стимулирование клеток, инициирующих опухоль).

При гепатоме активация местной иммунной системы, вызванная старением, также, как было показано, активирует клиренс (снижение числа) предзлокачественных гепатоцитов. Напротив, стареющие клетки также могут способствовать уклонению опухоли от иммунного надзора. Во время старения кожи стареющие стромальные клетки и их SASP (особенно IL6) вызывают увеличение количества супрессивных миелоидных клеток. Кроме того, было показано, что это приводит к ингибированию противоопухолевых Т-клеточных ответов и усилению роста опухоли; все это способствует развитию старческой меланомы.

Наблюдающийся в течение жизни клетки эффект Хейфлика состоит из трех основных «факторов Хейфлика» ( потеря теломер, накопление повреждений ДНК и дерепрессия локуса INK4a / ARF ). Теломеры состоят из повторяющихся элементов ДНК на концах линейных хромосом, которые защищают концы ДНК от деградации и рекомбинации. Из-за внутренней неспособности репликационного аппарата копировать концы линейных молекул, теломеры становятся все короче с каждым раундом деления клетки. В конце концов, теломеры достигают критически короткой длины, ведя себя как двухцепочечные разрывы ДНК, которые активируют белок-супрессор опухоли p53, что приводит к инициированному теломерами старению или апоптозу.

Критически короткие или дисфункциональные теломеры можно рассматривать как особую форму повреждения ДНК, и как таковые они маркируются фосфорилированным гистоном H2AX (γH2AX); впрочем, не все возрастные очаги γH2AX связаны с теломерами.
Принимая во внимание, что старение связано с накоплением окислительного повреждения, можно предположить, что укорочение теломер может отражать не только пролиферативную историю клетки, но также накопление окислительного повреждения.

Теломераза - это рибонуклеопротеин с активностью ДНК-полимеразы, который удлиняет теломеры, но его уровень активности в большинстве тканей взрослого человека недостаточен, чтобы компенсировать прогрессирующее истощение теломер, которое происходит с возрастом.

Так наз. теломерные часы ограничивают не только пролиферацию нормальных нераковых клеток, но также пролиферацию тех клеток, которые уже находятся на пути к неопластической трансформации.
Лучше всего это иллюстрируется тем фактом, что практически все раковые клетки человека приобрели механизмы для поддержания теломер, как правило, за счет экспрессии высоких уровней теломеразы. В исключительных случаях раковые клетки могут поддерживать свои теломеры в отсутствие теломеразы за счет гомологичной рекомбинации между теломерами. Значит теломераза является онкогенным фактором, способствующим прогрессированию опухоли.

Два основных исключения из этой общей тенденции возникают, когда недостаток теломеразы сочетается с недостатком p53 или со сверхэкспрессией теломер-связывающего белка TRF2, который рекрутирует нуклеазу XPF на теломеры и разрушает их. В этих условиях клетки размножаются в присутствии безудержных хромосомных аберраций, что, в свою очередь, способствует развитию рака.

Механизм репарации ошибочного спаривания ДНК, в частности фактор репарации ДНК PMS2, участвует в запуске остановки пролиферации и старения за счет потери теломер в процессе, который, по-видимому, находится выше p21Cip1. Это отделяет функцию пролонгирования укорочения теломер (PMS2- и p21Cip1-зависимую) от противоопухолевой функции укорочения теломер (p53-зависимую, но независимую от p21Cip1).

Продолжим.

Старение опосредуется двумя основными путями опухолевого супрессора клетки, а именно путями ARF / p53 и INK4a / RB, поэтому индуцированное онкогеном старение есть механизм, сдерживающий рост потенциально опасных клеток. ARF является критическим сенсором онкогенных сигналов, а критическим медиатором, который активирует p53 в ответ на онкогенную передачу сигналов, является каскад передачи сигналов повреждения ДНК, запускаемый аберрантным запуском фактроров репликации.

Клетки, которые стареют с устойчивой передачей сигналов DDR, содержат устойчивые ядерные фокусы, называемые сегментами ДНК с изменениями хроматина, усиливающими старение (DNA-SCARS). Эти очаги содержат активированные белки DDR, включая фосфо-ATM и фосфорилированные ATM / ATR субстраты, и отличимы от временных очагов повреждения. ДНК-SCARS включают дисфункциональные теломеры или очаги, вызванные дисфункцией теломер (TIF).

Предраковые поражения в легких содержали большое количество стареющих клеток, тогда как аденокарциномы легких почти полностью лишены клеток, положительных по маркерам индуцированного онкогеном старения. Точно так же предраковые невусы и аденомы толстой кишки человека содержали клетки, экспрессирующие маркеры старения, включая передачу сигналов SA-β-gal (Senescence-associated beta-galactosidase) и DDR; однако число стареющих клеток заметно уменьшились в злокачественных меланомах и аденокарциномах, которые развиваются из этих поражений.

У людей стареющие клетки были идентифицированы в доброкачественных поражениях кожи, несущих онкогенный мутант BRAF (BRAFE600); в нейрофибромах пациентов с мутантом NF1 - генетический дефект, который приводит к постоянно высоким уровням активности Ras; и при доброкачественных поражениях простаты. Генетические манипуляции, отменяющие реакцию старения, приводят к полномасштабной злокачественной опухоли. Так, после делеции Suv39H1, гена, кодирующего гистоновую H3-лизин-9-метил -трансферазу, которая, как полагают, участвует в образовании de novo ассоциированных со старением гетерохроматиновых фокусов (SAHF), которые заглушают критические пролиферативные гены, развивается злокачественная лимфома.

Умеренные уровни активности Ras запускают гиперплазию молочных желез, но не способны продуцировать опухоли. Более высокие уровни Ras (аналогичные тем, которые обнаруживаются в спонтанных опухолях) запускают старение и приводят к злокачественным опухолям, когда нарушаются пути, вызывающие старение. Эти результаты также распространяются на Raf, решающий нижестоящий эффектор для Ras-индуцированного старения.
В этом смысле химиотерапевтическое вмешательство, направленное на запуск старения, может оказаться эффективным. Так, для некоторых типов опухолей, таких как гепатокарциномы или саркомы мягких тканей, регресс опухоли может достигаться за счет старения.

Факторы, запускающие старение, также запускают апоптоз и покой, что затрудняет анализ вклада каждой из этих реакций на старение. Клеточное старение может влиять на старение посредством двух неисключительных и, возможно, сопутствующих механизмов :
1. Накопление стареющих клеток в тканях может достигать точки, которая ставит под угрозу функциональность ткани;
2. Старение может ограничивать регенеративный потенциал взрослых стволовых клеток (ограничение, которое также может быть вызвано покоем или апоптозом стволовых клеток).

Стареющие клетки, в отличие от нормальных клеток, обеспечивают лучшую среду и стромальную поддержку раковых клеток (см. выше). Согласно этому представлению, пожилые организмы более подвержены раку из-за комбинации двух факторов: накопления онкогенных мутаций и благоприятной среды для роста рака. Так, многие факторы SASP стимулируют фенотипы, связанные с агрессивными раковыми клетками. Например, стареющие фибробласты секретируют амфирегулин и связанный с ростом онкоген (GROα), которые в моделях клеточных культур стимулируют пролиферацию предраковых эпителиальных клеток. Старые клетки также секретируют высокие уровни интерлейкина 6 (IL-6) и IL-8, которые могут стимулировать предраковые и слабо злокачественные эпителиальные клетки к вторжению в базальную мембрану.

Временная организация стареющего фенотипа : одним из самых ранних событий после остановки роста, является экспрессия IL-1α. Этот цитокин, связанный с клеточной поверхностью, активирует ядерный фактор факторов транскрипции κB (NF-κB) и C / EBPβ, которые необходимы для экспрессии многих белков SASP. Эти действия предшествуют экспрессии белков, которые позволяют иммунной системе убирать стареющие клетки, которые экспрессируют связанные с поверхностью лиганды и молекулы адгезии, на которые нацелены естественные киллеры и другие иммунные клетки, хотя неизвестно, когда эти белки экспрессируются относительно SASP.

Поскольку число стареющих клеток увеличиваются с возрастом, то либо клиренс является неполным (и поэтому стареющие клетки постепенно накапливаются), либо пожилые люди генерируют стареющие клетки быстрее, чем их иммунная система может справиться, либо и то, и другое.
Наконец, стареющие клетки в конечном итоге экспрессируют две микроРНК, mir-146a и mir-146b, которые составляют петлю отрицательной обратной связи для подавления активности NF-κB.
Индукция этих miRNAs может препятствовать тому, чтобы SASP генерировал стойкое острое воспаление, которое, в отличие от хронического воспаления низкого уровня, предназначено для самоограничения. Однако, несмотря на их индукцию, воспалительный ответ может сохраняться, хотя и на низком хроническом уровне, и он может вызывать хронические патологии, связанные со старением.

Расскажем еще о сумоилировании.

SUMOylation - это посттрансляционная модификация, в которой белок из 97 остатков, SUMO (Small Ubiquitin-related Mоdifier) ​​ковалентно присоединяется к специфическим остаткам лизина в белке-мишени. Несмотря на свою ковалентность, это очень кратковременная модификация из-за действия высвобождающих SUMO изопептидаз, названных SENP — SUMO-специфические протеолитические ферменты. Поэтому конъюгация SUMO действует как быстро обратимый переключатель, который может способствовать или ингибировать взаимодействия с белком-субстратом. Статус SUMOylation для все большего числа белков-субстратов играет решающую роль в клеточных реакциях на метаболический и генотоксический стресс, то есть похоже, что повышенное SUMOylation представляет собой клеточную защитную реакцию.

SUMOylation лучше всего охарактеризовано для ядерных белков, участвующих в целостности генома, ядерной структуре и транскрипции, но помимо ядра выяснилось, что SUMOylation играет критическую роль в передаче сигналов, перемещении и модификации цитозольных и интегральных мембранных белков. Так показано, что сумоилирование необходимо для ядерного транспорта в нервной ткани фактора DJ-1, который подавляет транскрипционную активность р53, и мутации в котором зачастую связаны с развитием ранней аутосомно-рецессивной формы болезни Паркинсона.

Есть три подтвержденных паралога SUMO (SUMO-1–3) у позвоночных. SUMO-2 и SUMO-3 идентичны, за исключением трех остатков, но имеют только ~ 48% идентичности последовательности с SUMO-1. Существуют также значительные различия в динамике конъюгации SUMO-1 и SUMO-2/3 и ответах на клеточный стресс. В условиях покоя существует очень мало неконъюгированного SUMO-1, тогда как существует большой свободный пул SUMO-2/3. В целом SUMO-1, по-видимому, участвует в основном в нормальной клеточной физиологии и поддержании, тогда как SUMO-2/3 преимущественно участвует в ответах на клеточный стресс.

Протеолиз белка SUMO осуществляется на С-конце полипептидной цепи, освобождая два остатка аминокислоты глицина — GG. Данная стадия процесса сумоилирования называется «созревание» и осуществляется SUMO-специфическими протеолитическими ферментами — SENP-протеазы у млекопитающих. Далее наш маленький белок SUMO активируется Е1-активирующим ферментом (гетеродимер Aos1/Uba2) и переносится на фермент Е2 (Ubc9). После этапа активации SUMO конъюгируется с субстратом в реакции, которая катализируется ферментами Е3. Как и в случае убиквитинилирования, на молекулу белка-субстрата может переноситься как один остаток SUMO (моносумоилирование), так и несколько (полисумоилирование).
Модификация белков SUMO гораздо реже обнаруживается для большинства белков в клетках по сравнению с модификацией Ub. Основная причина этого различия заключается в том, что модификация SUMO нацелена не на деградацию, а на изменение функции.

Продолжим.

SENP сильно сконцентрированы в ядре. SENP1 и SENP2 демонстрируют дискретное распределение в ядерных порах и субъядерных компартментах. Оба содержат мотивы сигнала ядерной локализации (NLS) и сигнала ядерного экспорта (NES), позволяющие им перемещаться между ядром и цитоплазмой. SENP3 и SENP5 преимущественно локализуются в ядрышке. SENP6 и SENP7 присутствуют в нуклеоплазме, а SENP6 частично совмещается с ядерными тельцами белков промиелоцитарного лейкоза.

B ответ на стресс увеличенный SENP1, вероятно, усиливает созревание pro-SUMO, делая более активным SUMO доступным для конъюгации, тем самым облегчая глобальное SUMOylation и, в то же время, на фоне повышенного SUMOylation, селективно деконъюгирует SUMO из определенных белков-субстратов.

Стабильность SENP3 контролируется опухолевым супрессорным белком p19 (ARF), который ускоряет зависящий от убиквитин-протеасомной системы (UPS) оборот SENP3. Карбоксильный конец ubiquitin ligase Hsc70-взаимодействующего белка (CHIP) обеспечивает убиквитинирование SENP3 и последующую деградацию в базовых условиях. В стрессовых условиях, однако, SENP3 ассоциируется с молекулярным шаперонным белком теплового шока 90 (Hsp90), который защищает его от CHIP-обеспечиваемого убиквитинирования, тем самым приводя к увеличению уровней SENP3.

Установлено. что функциональные группы / кластеры / сети белков в определенных субклеточных местоположениях подвергаются одновременному SUMOylation в ответ на клеточный стресс. Это подтверждает теорию "Spray", по которой конъюгация SUMO происходит одновременно на пространственно связанных группах субстратов.

SUMOylation, вероятно, обеспечивает механизм защиты клеток от смертельно низких уровней кислорода и глюкозы. Перекись водорода (H2O2) вызывает окислительный стресс и вызывает сложные изменения в глобальных уровнях конъюгации SUMO. Так, SENP1 недавно был идентифицирован как ген гипоксического ответа. Избыточная экспрессия каталитического домена SENP1 увеличивает гибель нейронов в ответ на ишемию. Однако deSUMOylation с помощью SENP1 было предложено как цитопротективное для H2O2 - индуцированной гибели клеток, а истощение SENP1 либо за счет интерференции RNAi (РНК-интерференция (RNAi) - это средство подавления генов посредством деградации мРНК), либо за счет генетического нокаута способствует гибели клеток. SENP3 увеличивается после травматического повреждения спинного мозга, сопутствующего активации каспазы 3.

Стресс эндоплазматического ретикулума (ER) возникает, когда неправильно свернутые белки накапливаются в просвете ER. Это ведет к сложной серии трансляционных и транскрипционных событий, которые пытаются восстановить правильную функцию ER путем ингибирования общего синтеза белка, но способствуя транскрипции шаперонов ER и ферментов фолдинга для усиления процессинга ER и облегчения агрегации белков. В зависимости от степени стресса, развернутый белковый ответ (UPR) может быть либо про-выживанием, либо про-апоптозом, при этом SUMOylation представляет собой новый компонент UPR, который участвует в определении баланса между выживанием и гибелью клеток.

Вкратце, существует три ветви UPR, которые включают инозитол-требующую киназу 1α (IRE1α), протеинкиназоподобную киназу эндоплазматического ретикулума (PERK) и активирующий фактор транскрипции 6 (ATF6). SUMOylation участвует как в путях IRE1α, так и в путях PERK.
Путь IRE1α незаменим для восстановления сворачивания белков или деградации развернутых белков. IRE1α представляет собой ER-трансмембранный белок с киназным доменом и обладает эндонуклеазной активностью. Автофосфорилирование IRE1α запускает сплайсинг мРНК фактора транскрипции XBP1 в активную форму (XBP1s). XBP1s подвергаются SUMO-1- и SUMO-2/3-илированию, опосредованному SUMO E3 лигазой PIASx, указывая тем самым, что сделан еще один ключевой шаг в активации UPR, а гомеостаз ER регулируется с помощью SUMOylation.

PERK активируется посредством автофосфорилирования, которое, в свою очередь, фосфорилирует и инактивирует eIF2α, который подавляет глобальный синтез белка за счет быстрого снижения инициации трансляции. PERK активируется во время церебральной ишемии и реперфузии in vivo и имеет решающее значение для выживания клеток в условиях крайней гипоксии.

Еще модификация Drp1 (Dynamin-1-like protein) с помощью SUMO-1 может способствовать делению митохондрий, тогда как модификация SUMO-2/3 предотвращает это. Более того, SENP5 и SENP3, по-видимому, по-разному регулируют SUMO-1- и SUMO-2/3-илирование Drp1, соответственно потенциально обеспечивая высокочувствительную и детализированную систему регуляции для контроля динамики митохондрий.

Агрессивный подтип PDAC (рак поджелудочной железы) демонстрирует гиперактивность основного пути SUMO и, таким образом, связывает путь SUMO с менее дифференцированными PDAC - базальным подтипом - и н***агоприятный прогнозом. Так, белок 1, взаимодействующий со Smad ядра (SNIP1), динамически де- и ре-SUMOилировался в ответ на лечение гемцитабином; вообще, нарушение равновесия SUMOylation является обычным явлением для фенотипов PDAC, устойчивых к лекарствам.

Так, ядерные тельца белка промиелоцитарного лейкоза (PML) участвуют в регуляции клеточных процессов, имеющих отношение к подавлению опухоли, таких как репарация ДНК и реакция на повреждение ДНК (DDR). Было показано, что функция этих ядерных органелл зависит от соответствующего SUMOилирования основного структурного компонента PML, а гипосумоилирование PML в клетках PDAC было связано с повышенной активацией пути NFκB для опосредования устойчивости к гемцитабину и повышенной активации пути связывания элемента ответа цАМФ, опосредующий устойчивость к оксалиплатину.

Опухолевые клетки подвергаются ограниченному поступлению питательных веществ и гипоксии. Гипоксия запускает адаптивные сигнальные пути, чтобы гарантировать выживание и перестройку клеточного метаболизма, например, индукцию гликолиза. При этом сверхэкспрессируется SUMO-лигаза E3-типа PIAS4 (белковый ингибитор активированного белка STAT 4) и способствует SUMOylation и инактивации VHL (см. выше), что необходимо для полной стабилизации HIF1α. Участие пути SUMO в контроле DDR может объяснить, как лиганд SUMO-2/3 на наночастицах золота повышает чувствительность раковых клеток к облучению.

Амплификация MYC, которая была обнаружена примерно у 14% пациентов с PDAC, является единственной вариацией числа копий, связанной с плохой выживаемостью пациентов с PDAC. Амплификации MYC положительно выбираются во время прогрессирования опухоли, причем активность MYC связана с базальным подтипом заболевания.

Синтетическая летальность обычно относится к ситуации, в которой индивидуальное нацеливание на каждый ген в паре генов допустимо, но комбинированная инактивация вызывает резкое снижение выживаемости раковых клеток. Синтетическая летальность также может возникать между генами и небольшими молекулами, что подтверждается чувствительностью опухолевых клеток, несущих мутации в гене репарации ДНК BRCA1 / 2, к ингибиторам поли-АДФ-рибозо-полимеразы (PARP) и некоторым химиотерапевтическим препаратам, таким как соединения платины. Действительно, преимущества терапии платиной или ингибирования PARP были продемонстрированы у пациентов с BRCA1 / 2 - мутированной PDAC.

Примечательно, что особый вид синтетической летальности, называемый летальностью синтетической дозы, определяет ситуацию, в которой гиперактивность одного гена порождает зависимость от продукта другого гена, и имеет значение в контексте пути MYC. Так, выявлена синтетическую летальность компонентов пути SUMO SAE1 и SAE2 с MYC, подтвержденная при гематологических злокачественных новообразованиях и мелкоклеточном раке легкого (SCLC).

Повышенная экспрессия MYC приводит к митотическим изменениям и создает уязвимости в делящейся клетке, например, повышенная экспрессия MYC связана с неправильным выравниванием хромосом в метафазе с последующим отставанием хромосом в анафазе. Следовательно, раковые клетки с высокой активностью MYC зависят от защитных путей, чтобы справиться с этим конкретным стрессом. Эти защитные пути, которые включают механизм SUMOylation, позволяют клеткам адаптироваться к митотическому стрессу. Блокирование пути SUMO вызывает остановку клеточного цикла в фазе G2 / M, полиплоидию и последующую гибель клеток.

TPX2 (кинезиноподобный белок 2 Xenopus) необходим для сборки веретена во время митоза, и ген непосредственно активируется с помощью MYC. В то время как нормальным клеткам требуется небольшое количество белка для сборки веретена, раковые клетки с высокой экспрессией MYC зависят от TPX2, чтобы эффективно формировать веретено и прогрессировать через митоз, то есть TPX2 является синтетическим летальным геном, ассоциированным с MYC. Вообще, многие белки, несущие множественные сайты SUMO, являются митотическими белками, и все BIRC5, EG5 и TPX2 могут быть SUMOylated.

Рак никуда не денется.
Лучше про корону, мутации, вакцины, тромбы запузырь и что с этой приблудой делать ?

Что делать?... работать с ними, как говаривал товарищ Сталин, благо соответствующие технологии имеются. Я же уже на пенсии и могу только по-стариковски ковыряться на таком интереснейшем и благодатном поле, каким является рак.

Продолжим.

SUMO PTM представляет собой динамический биомаркер реакции на применяемые в настоящее время химиотерапевтические методы. Кроме того, исследование специфической роли SENP, которые в нормальных клетках жестко контролируют равновесие SUMOylation, может предоставить информацию для дополнительного фармакологического вмешательства в MYC / SUMO-активированный PDAC и другие виды рака. Впрочем, для более точного определения доли PDAC, чувствительной к ингибитору SAE, следует рассмотреть другие маркеры, помимо MYC. Клинические данные на примере рака толстой кишки указывают на ценность комбинации двух или более целевых методов лечения для лечения солидного рака. Кроме того, первый в своем классе ингибитор СУМО, ТАК-981, продемонстрировал иммуномодулирующие свойства.

Каскад SUMOylation уравновешивает передачу сигналов врожденного иммунитета посредством регулирования ответов интерферона I типа (IFN) и активности NF-каппа-B (NF-k B). Так, СУМОилирование IFN-регуляторного фактора транскрипции IRF3 отрицательно регулирует транскрипцию IFNβ. Следовательно, десумоилирование IRF3 с помощью SENP2 индуцирует транскрипцию IFNβ.

Еще одним эффектором нашего врожденного иммунитета является GMP-AMP-синтаза (cGAS), которая воспринимает вирусную ДНК и, следовательно, активирует стимулятор генов интерферона (STING). Впоследствии STING стимулирует IFN 1-го типа. Лигаза E3 TRIM38 SUMOилирует cGAS и STING, что приводит к их стабилизации на ранних стадиях после заражения. В позднем инфекционном состоянии SENP2 де-СУМОилирует cGAS и STING, что приводит к их деградации и, таким образом, снижает иммунный ответ. Напротив, также было обнаружено, что SUMOylation подавляет потенциал восприятия ДНК cGAS, который может быть снят с помощью SENP7, показывая в целом подавляющий эффект SUMOylation на активацию иммунной системы (см. выше).

Фенотипическими характеристиками, иллюстрирующими потерю SUMOylation в клетках, являются анеуплоидия и образование хроматинового мостика. Оставшийся участок ДНК между двумя дочерними клетками в случае образования хроматинового мостика мешает клеткам должным образом делиться и запускать свой собственный независимый клеточный цикл. В целом аберрантная экспрессия протеаз SUMO останавливает пролиферацию клеток и приводит к дефектной морфологии ядра и двуядерным клеткам.

Существует все больше исследований, связанных с SUMOylation, и основное внимание уделяется ингибиторам регуляторов SUMOylation. SUMO E1 представляет собой димер, состоящий из субъединиц SAE1 и UBA2 / SAE2 и нокдаун этих субъединиц блокирует пролиферативную способность раковых клеток. Так, ингибиторы лигазы SUMO E1 обладают преимуществами более высокой селективности и меньшего количества побочных эффектов. Первые зарегистрированные ингибиторы SAE1 / 2 представляют собой природные соединения, включая гинкголиновую кислоту, ее структурный аналог анакардиновую кислоту и керриамицин B. Эти соединения ингибируют образование промежуточного соединения SAE1 / 2-SUMO, следовательно, блокируя конъюгацию SUMO с белками-мишенями. Другим природным веществом, блокирующими SAE1 / 2, является дубильная кислота с аналогичный механизм действия.

Ограничения этих натуральных продуктов состоят в том, что они в основном функциони -руют в микромолярном диапазоне и не нацелены только на сумоилирование. Известно, что гинкголевая кислота нацелена на провоспалительные молекулы, такие как простагландины и лейкотриены, и дубильная кислота может также вызывать гибель раковых клеток через активацию апоптоза, а не через ингибирование прогрессирования клеточного цикла, как ожидается для ингибитора SUMOylation.

Полипептиды цистеиновых протеаз могут действовать как аналоги SENP и обладают способностью отщеплять SUMO от целевого белка и / или расщеплять форму предшественника SUMO с высвобождением его активной формы.

Пять регуляторов SUMOylation (PIAS1, PIAS3, SENP8, SUMO4 и TRIM27), которые присутствовали в сигнатуре риска. Большинство этих регуляторов обладают значительным активационным эффектом в пути клеточного цикла, а в пути RAS / MAPK обладают значительным ингибирующим действием. Биологические эффекты этих регуляторов в онкогенезе и развитии разнообразны.
Эти регуляторы могут быть потенциальным индикатором прогноза множественных опухолей. Эти регуляторы SUMOylation имеют более низкую общую среднюю частоту мутаций при 33 типах рака, хотя регуляторы SENP1, SENP5, SENP7 и PIAS3 имеют более высокие частоты мутаций. SENP2, SENP5, CBX4 и TRIM27 показали более обширную CNV амплификацию (сopy number variation - - это явление, при котором участки генома повторяются, а количество повторов в геноме варьируется от человека к человеку); напротив, SENP3 и SUMO4 имели более обширные CNV делеции.

SENP1 высоко экспрессируется в образцах рака простаты человека и коррелирует с экспрессией индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF1α). SENP1 индуцирует транс -формацию здоровой простаты в предраковые поражения in vitro и in vivo. PIAS1 и PIAS4 необходимы в процессе репарации после повреждения ДНК. SENP1 может регулировать MMP-2 и MMP-9 через сигнальный путь HIF1α, тем самым способствуя прогрессированию клеточных линий рака простаты и метастазам в кости.

Связанный с аутофагией белок 8 ( Atg8 ) представляет собой убиквитиноподобный белок, необходимый для образования мембран аутофагосом. Временная конъюгация Atg8 с аутофагосомной мембраной посредством ubiquitin-подобной системы конъюгации важна для аутофагии у эукариот. У высших эукариот Atg8 не кодируется одним геном, как у дрожжей, а происходит из мультигенного семейства. Четыре его гомолога уже идентифи -цированы в клетках млекопитающих.
Одним из них является LC3 ( MAP1LC3A ), легкая цепь белка 1, связанного с микротрубоч -ками. Подобно Atg8, LC3 необходимо протеолитически расщеплять и липидировать, чтобы превратить в активную форму, которая может локализоваться на мембране аутофагосомы. Подобно ситуации с дрожжами, процесс активации LC3 запускается истощением питатель -ных веществ, а также в ответ на гормоны. Изоформы LC3 млекопитающих содержат консервативный Ser / Thr12, который фосфорилируется протеинкиназой А для подавления участия в аутофагии / митофагии.
Другими гомологами являются транспортный фактор GATE-16 (усилитель АТФазы, ассоциированный с Гольджи, 16 кДа), который играет важную роль в везикулярном транспорте внутри Гольджи, стимулируя активность АТФазы NSF (N-этилмалеимид-чувствительный фактор) и GABARAP (белок, связанный с рецептором γ-аминомасляной кислоты типа A), который облегчает кластеризацию рецепторов GABAA в сочетании с микротрубочками.
Все три белка характеризуются процессами протеолитической активации, в результате которых они липидируются и локализуются на плазматической мембране. Однако для GATE-16 и GABARAP мембранная ассоциация, по-видимому, возможна даже для нелипидированных форм. взаимодействия с одним из гомологов ATG4 млекопитающих, hATG4A.

Еще одним убитиквиноподобным белком является ATG12 Autophagy related 12); аутофагия - это процесс разрушения большого количества белка, при котором компоненты цитоплазмы, включая органеллы, заключены в двухмембранные структуры, называемые аутофагосомами, и доставляются в лизосомы или вакуоли для деградации.
Аутофагия требует ковалентного присоединения белка Atg12 к ATG5 через систему конъюгации, подобную убиквитину. Конъюгат Atg12-Atg5 затем способствует конъюгации ATG8 с липидным фосфатидилэтаноламином. Было также обнаружено, что Atg12 участвует в апоптозе. Этот белок способствует апоптозу за счет взаимодействия с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 .

Отметим, что ATG5 является ключевым белком, участвующим в расширении фагофорной мембраны в аутофагических пузырьках. ATG5 также может действовать как проапоптотическая молекула, нацеленная на митохондрии . При низких уровнях повреждения ДНК ATG5 может перемещаться в ядро и взаимодействовать с сурвивином .

Вернемся к расширенной версии рака желудка.

Из трех основных типов злокачественных опухолей желудка, аденокарциномы желудка (GC), неходжкинской лимфомы и стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, приблизительно 95% составляют GC, который остается одним из наиболее часто диагностируемых видов рака в мире.

Опухоли чаще возникают в антруме или нижней трети желудка, наиболее часто на малой кривизне. Некоторые из таких опухолей многоцентровые. Их локализация, видимо, меняется с возрастом, с увеличением проксимальных опухолей и снижением их в антруме.

РЖ подразделяют на 2 основные категории: ранний (early carcinoma) и распространенный (advanced carcinoma). К раннему относят рак, поражающий слизистую оболочку желудка или подслизистый слой, независимо от наличия или отсутствия метастазов в лимфатических узлах, которые можно диагностировать лишь гистологически. При нем 5-летняя выживаемость находится в пределах 90-100 %.

Процесс опухолевой трансформации клеток до первых клинических проявлений РЖ длительный, многоэтапный. Продолжительность «естественной эволюции» РЖ составляет 15-25 лет, что обусловливает возможность его диагностики на ранней стадии, которая может продолжаться с момента обнаружения заболевания от 6 мес до 10 лет и более. Лица с высокой степенью риска заболевания РЖ, у которых морфологически была диагностирована тяжелая интраэпителиальная неоплазия (дисплазия) эпителия, подлежат динамическому наблюдению с обязательным проведением рентгеноскопии и гастроскопии не менее чем 2 раза в год.

РЖ - очень гетерогенное заболевание с морфологической и молекулярной точек зрения. Также гистологическое строение РЖ отличается многообразием форм аденокарциномы, происходящей из камбиальных эпителиальных клеток слизистой желудка, находящихся в области шейки желудочных желез. Размножаясь эти клетки как поднимаются в зону покровного эпителия, так и спускаются в главную часть желез; этим железы желудка напоминают крипты толстой кишки.

Во многих случаях обнаруживаются сочетания различных гистологических форм РЖ. По мере инвазии карциномы в глубь стенки желудка комплексы опухолевых клеток зачастую утрачивают дифференцировку и предстают в виде мелких лимфоцитоподобных клеток, образуя тяжи и мелкие трубчатые структуры.

Кардиальная GC делится на две различные этиологические сущности: GC кардии, подобной пищеводу, которая связана с гастроэзофагеальным рефлюксом, курением и диетой и часто встречается в регионах с низким риском GC, и дистальной желудочно-подобной GC кардии, связаной с наличием H. pylori и атрофией слизистой, и является наиболее частым вариантом GC кардии в регионах с высоким риском GC.

GC некардиального типа в соответствии с классификацией Лорена подразделяются на два гистологических варианта, называемые GC кишечного и диффузного типов. Оба типа РЖ одинаково ассоциированы с H. pylori инфекцией, однако H. pylori инфекция может играть роль только на начальных этапах канцерогенеза. GC кишечного типа характеризуется образованием железистых структур, дистальной локализацией в желудке и обычно встречается у пожилых людей. Она также чаще встречается у мужчин (соотношение 2: 1) и у лиц с более низким социально-экономическим статусом. Этому типу GC часто предшествует предраковая фаза, которая начинается с перехода нормальной слизистой оболочки в мультифокальный атрофический гастрит. Это первоначальное гистологическое изменение сопровождается кишечной метаплазией, дисплазией и, наконец, аденокарциномой.

Высокая пролиферативная активность клеток «кишечного» рака определяет высокую скорость их роста. Быстрое клиническое течение рака интестинального типа определяет его ранние клинические проявления, а тесная связь клеток ведет к меньшей инвазивности, чем обеспечивается возможность радикальной операции. Так, интестинальные опухоли, как правило, являются экзофитными, часто изъязвляются, ассоциированы с гастритом тела желудка, с атрофией и кишечной метаплазией. Кишечный тип рака состоит из клеток, формирующих железы. Четко формируемые железы определяются как высокодифференцированная аденокарцинома, плохо формируемые железы – как низкодифференцированная аденокарцинома.

Диффузный тип рака обладает более низкой пролиферативной активностью, что определяет длительность латентного течения таких опухолей. Слабая связь клеток друг с другом ведет к высокой инвазивности диффузного рака, что определяет больший объем радикального оперативного вмешательства и объясняет более низкий процент 5-летней выживаемости. С другой стороны, GC диффузного типа плохо дифференцируется, поражает более молодых людей и тесно связана с генетической предрасположенностью (вариант наследственного диффузного GC, который связан с мутациями зародышевой линии в CDH1, гене, кодирующем E-кадгерин). Кроме того, она не связана с формированием предраковых поражений и, как было установлено, распостраняется на всю поверхность желудка. Этот тип GC одинаково присутствует у представителей обоих полов и связан с худшим прогнозом по сравнению с GC кишечного типа.

Отметим, что гетерозиготные мутации зародышевой линии неоднократно обнаруживались в гене E-кадгерина ( CDH1 ) и гене α-E-катенина ( CTNNA1 ), что подчеркивает их инактивацию и, следовательно, снижение сцепления клеток. Мутации этих генов считаются главной причиной HDGC ( наследственный диффузный рак желудка - см.выше ). У людей с мутацией в гене CDH1 пожизненный риск диффузного рака желудка оценивается к 80 годам от 67% до 70% для мужчин и от 56% до 83% для женщин. Женщины с мутацией в гене CDH1 имеют также к 80 годам примерно от 39% до 52% риска развития дольчатого рака молочной железы.

Если поподробней, то семейная или наследственная диффузный рак желудка является аутосомно доминирующей наследственной предрасположенностью к канцерогенезу клеток желудка в зародышевой линии на основе мутаций в гене CDH1. Опухоль проникает в стенку желудка и обычно приводит к утолщению стенки, не будучи видимым в виде язвы (как при кишечном раке желудка).

Обычно каждая клетка имеет по 2 копии каждого гена: 1 унаследован от матери и 1 унаследован от отца. HDGC следует аутосомно-доминантному типу наследования, при котором мутация происходит только в 1 копии гена. Это называется мутацией зародышевой линии. Следовательно, ребенок, у которого есть родитель с мутацией, имеет 50% шанс унаследовать эту мутацию.

Средний возраст начала HDGC у носителей мутации - 38 лет (диапазон от 14 до 69 лет), кумулятивный риск развития HDGC до 80 лет составляет 80% для мужчин и женщин. Если затронутые семьи соответствуют указанным ниже критериям показаний, частота обнаружения мутаций в CDH1 составляет 25-50%. Поэтому мутации в этом гене, вероятно, не единственная причина семейной диффузной карциномы желудка.

В семьях с признаками мутаций риск заболевания низок до 20 лет, поэтому профилактическая гастрэктомия рекомендуется носителям в возрасте от 20 лет (исключения в особенно раннем возрасте появления в семье). В подвергшихся контролю семьях без признаков мутации результаты патологической биопсии (гастроскопия один раз в год, 30 биопсий) являются показанием для гастрэктомии.

Смешанный РЖ, определяемый двойным паттерном дифференцировки - железистая / солидная (кишечная) и изолированно-клеточная карцинома (диффузная) демонстрирует двойную метастатическую картину (гематогенные метастазы и перитонеальное распространение с метастазами в лимфатические узлы), предполагая кумулятивный эффект н***агоприятного поведения кишечного и диффузного GC.

Продолжим.

В группу риска развития РЖ следует отнести лиц, с детского возраста имеющих высокие показатели обсемененности слизистой оболочки H. pylori или страдающих заболеваниями, ассоциированными с хеликобактериозом; пациентов, в течение значительного времени страдающих хроническим гастритом (как с пониженной, так и с нормальной или повышенной кислотностью), аденомами (аденоматозными полипами), язвенной болезнью желудка, пернициозной анемией, с резецированным желудком, болезнью Менетрие, а также в случае семейной предрасположенности к РЖ.

Так как в здоровой слизистой оболочке рак практически не возникает, в последние годы сформировалось представление о предраковой патологии желудка, в спектре которой Н. pylori-ассоциированный хронический гастрит занимает центральное место. Впрочем, хотя инфекция H. pylori была признана наиболее важным фактором риска развития GC и классифицирована Всемирной организацией здравоохранения в 1994 году как канцероген класса 1, этиология GC также включает факторы хозяина и окружающей среды. Об этом свидетельствует тот факт, что только у 1–3% пациентов, инфицированных H. pylori, развивается GC, и что прогрессирование до GC у некоторых субъектов происходит даже после уничтожения бактерии.

Имеются данные, что персистенция инфекции Н. pylori увеличивает риск развития рака желудка в 4-9 раз, особенно в случаях инфицирования в детском возрасте; в целом до 80% аденокарцином желудка связаны с Н. pilori-ассоциированным хроническим атрофическим пангастритом. Впрочем, современные представления состоят в том, что Н. pylori скорее действует в качестве промотора, чем инициатора желудочного канцерогенеза.
При инфекции экспрессия эпителиальными клетками IL-8 запускает цитокиновый провоспалительный каскад. Мобилизованные моноциты и нейтрофилы экспрессируют, в свою очередь, IL-10, являющийся одним из мощнейших ингибиторов кислотообразования. Таким образом, IL-10 потенцирует воспалительные изменения в слизистой оболочке и вызывает достаточно выраженную гипохлоргидрию, облегчающую колонизацию Н. pylori в желудке.

Helicobacter pylori - грамотрицательная бактерия, поражающая почти 50% населения человека. В слизистой оболочке желудка большая часть Helicobacter pylori находится в слое слизи, но они также могут прикрепляться к эпителиальным клеткам, что приводит к поддержанию, распространению и серьезности инфекции. Инфекция H. pylori была связана с развитием ряда заболеваний, включая язвенную болезнь (10%), некардиальную GC (1-3%) и лимфому, ассоциированную со слизистой оболочкой желудка (MALT) (<0,1 %).

Более того, эта бактерия ассоциирована с тремя различными фенотипами у инфицированного хозяина:
(1) гастрит с преобладанием поражения дна и тела желудка, который может привести к атрофическому гастриту, гипохлоргидрии и развитию GC; при фундальном и мультифокальном гастритах у 1% пациентов ежегодно развивается рак желудка и практически не встречаются дуоденальные язвы.
(2) фенотип язвы двенадцатиперстной кишки, при котором гастрит с преобладанием антрального отдела желудка приводит к повышенной секреции кислоты желудочного сока. Впрочем отмирание париетальных клеток без последующей регенерации начинается в антральном отделе желудка. В нём обнаруживают первичные очаги атрофии. Со временем болезнь прогрессирует, функционирующие железы заменяются кишечным слоем эпителия. Атрофический антральный гастрит при длительном течении опасен перерождением изменённых участков в злокачественную опухоль.
(3) доброкачественный фенотип, при котором бактериальная инфекция вызывает легкий смешанный гастрит, который оказывает незначительное влияние на выработку кислоты желудочного сока.

Отметим, что на фенотип Н. pylori-accoцииpoванного гастрита влияет секреция соляной кислоты. Если ее уровень низкий, Н. pylori может колонизировать любой отдел желудка, при сохранной (повышенной) кислотности единственным местом, где может выжить микроорганизм, является антральный отдел, для которого характерны более низкие значения рН. В этом случае ведущую роль в развитии конкретного фенотипа будет играть возраст, в котором произошло заражение, поскольку для детей более характерно состояние гипоацидности, а для взрослых - нормацидности.

Поверхностный гастрит с фундальной или мультифокальный локализацией приводит к потере желудочных желез с замещением их фиброзной тканью или (что более типично) метаплазированным эпителием. Именно этот вариант гастрита создаст фон для карциномы кишечного типа.

Динамическое наблюдение за больными, инфицированными Н. pylori, позволило выделить две формы хронического гастрита - хронический поверхностный и хронический атрофический, являющиеся, по сути, последовательными этапами развития хронического геликобактерного гастрита. С другой стороны, большинством специалистов, занимающихся вопросами геликобактерноза, выделяются два фенотипа геликобактерного гастрита - классический антральный и фундальный (мультифокальный). Именно топографические особенности гастрита, а не выраженность воспаления определяют клинические последствия инфицирования Н. pylori.

Необходимо отметить, что именно Cag-A-позитивные штаммы Н. pylori инициируют более высокий уровень пролиферации эпителиоцитов. При этом уровень апоптоза не соответствует ускоренной пролиферативной активности эпителия, возникает дисбаланс между гибелью клеток и их размножением, что увеличивает возможность "выживания" мутаций, имеющих канцерогенный потенциал. Отчасти это объясняется более активной экспрессией IL-8 Cag-А-позитивными штаммами Н. pylori, а следовательно, и более выраженным воспалением.

H. пилори приобретается в начале жизни, большинство людей заражается в возрасте до 10 лет при контакте с близкими, которые являются общим источником инфекции. Было высказано предположение, что раннее заражение может быть связано с широким спектром патологий, связанных с инфекцией H. pylori, и с очень устойчивыми уровнями заболеваемости GC в генетически восприимчивых популяциях, которые мигрировали в развитые страны. При отсутствии антибактериальной терапии H. pylori инфекция обычно сохраняется на всю жизнь.

Способность H. pylori выживать и колонизировать желудок связана с рядом механизмов. Самое главное: H. pylori в отличие от других бактерий вырабатывает большое количество фермента уреазы, гидролизующего мочевину до аммиака, который впоследствии взаимодействует с ионами водорода в желудке с образованием аммония. Можно еще отметить "недоступность" бактерии для антител в слое желудочной слизи, невозможность выделения IgG в просвет желудка при относительном дефиците секреторных IgA, а также "антигенную мимикрию" Н. pylori.
Кроме того, H. pylori экспрессирует несколько белков внешней мембраны, включая антигенсвязывающий адгезин группы крови (BabA), адгезин, связывающий сиаловую кислоту (SabA) и внешний воспалительный белок (OipA), которые, по-видимому, связываются с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток желудка, что снижает скорость выведения бактерий в результате перистальтики.

Тот факт, что более одного штамма H. pylori могут колонизировать слизистую оболочку желудка, дает H. pylori возможность приобретать новые генетические последовательности и подвергаться событиям рекомбинации.

Продолжим.

Хронический гастрит (некоторые исследователи его рассматривают как гастропатию, так как атрофические и пролиферативные процессы превалируют над воспалительными) предшествует возникновению рака желудка в 73,5-85 % случаев.

Установлено, например, что у 1% больных антральным хроническим гастритом ежегодно возникают дуоденальные язвы, но у них не развивается рак желудка; при фундальном и мультифокальном гастритах ежегодно у 1% пациентов развивается рак желудка и практически не встречаются дуоденальные язвы ("язвенный" и "раковый" фенотипы хронического гастрита по P. Sipponen). Возможное объяснение этому кроется в том, что фенотип Н. pylori-accoцииpoванного гастрита влияет на секрецию соляной кислоты. Если ее уровень низкий, Н. pylori может колонизировать любой отдел желудка, при сохранной (повышенной) кислотности единственным местом, где может выжить микроорганизм, является антральный отдел, для которого характерны более низкие значения рН. В этом случае ведущую роль в развитии конкретного фенотипа будет играть возраст, в котором произошло заражение, поскольку для детей более характерно состояние гипоацидности, а для взрослых - нормацидности.

Участки атрофии чередуются с участками разрастания соединительной ткани. Уплотнения появляются в случаях, когда острая фаза заболевания прошла без лечения. Такой процесс называют гиперплазией. Клетки в утолщённых участках активно делятся, что может привести к образованию полипов.
Аденоматозные полипы (аденомы) представляют собой аналог аденом толстой кишки. Эти новообразования имеют вид узла на широком основании. Микроскопически представляют собой тубулярные и тубулопапиллярные хаотические эпителиальные разрастания, выстланные высоким цилиндрическим эпителием, с вытянутыми и расположенными на различных уровнях ядрами и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Частота малигнизации аденом чрезвычайно высока и кол***ется, по данным большинства исследователей, в пределах 30-40 %.

Для обозначения предраковой эпителиальной пролиферации слизистой оболочки желудка, промежуточной между гиперплазией и раком, предложен термин «желудочная интраэпителиальная неинвазивная неоплазия» (синоним «дисплазия»). Для нее характерны нарушение дифференциации клеток с клеточной атипией, а также дезорганизация структуры слизистой оболочки.

Под кишечной метаплазией в слизистой оболочке желудка принято понимать замещение желудочного эпителия кишечным (см. выше). Метаплазия с наличием клеточных элементов тонкой или толстой кишки расценивается соответственно как тонко- и толстокишечная. Раньше тонкокишечную метаплазию отождествляли с полной метаплазией (метаплазия эпителия с наличием всех клеток, свойственных тонкой кишке), а толстокишечную - с неполной. Но даже при полной метаплазии не обнаруживается весь спектр клеток, характерных для тонкой кишки, а также нередкой встречаемостью смешанного типа кишечной метаплазии.

С позиций современного понимания процесса метаплазии как адаптивной перестройки на иной клеточный фенотип - более приспособленный к изменившимся условиям окружения, полную метаплазию можно рассматривать в качестве начального этапа такой перестройки, а неполную - как нарушение процессов дифференцировки. Так, при неполной метаплазии выявляются полиморфизм ядер, увеличение ядерно-цитоплазматических соотношений; поверхностные отделы желез практически не отличаются от глубоких, что говорит о нарушении созревания и аберрантной дифференциации. Все эти картины показывают сходство неполной кишечной метаплазии с дисплазией.

Важную роль в канцерогенезе GC принадлежит нарушениям процессов апоптоза и, соответственно, нарушениям в сигнальных путях, его регулирующих, прежде всего пути AKT, который наиболее часто подвержен гиперактивации. Для атрофического гастрита без хеликобактерного инфицирования характерен средний уровень ИА (индекса апоптоза) и низкий уровень экспрессии mTOR, при метаплазии слизистой отмечалось как повышение ИА, так и уровня экспрессии mTOR, а при раке желудка ИА значительно снижался, а экспрессия mTOR оставалась на высоком уровне. Учитывая высокмй уровень биосинтетических процессов в раковых клетках это не удивительно.

Регуляция пролиферации и апоптоза в эпителиоцитах при неполной кишечной метаплазии сильно нарушена, в некоторых из них выявляется мутация гена р53, что позволяет данным клеткам подвергнуться дальнейшему перерождению под влиянием различных мутагенов, вплоть до злокачественного, поскольку они защищены от апоптоза. Все эти явления не отмечаются при полной метаплазии, что позволяет утверждать - полная кишечная метаплазия не может быть предраком биологически.

Выявление неполной кишечной метаплазии показало высокую специфичность этого признака (98%) для рака желудка, однако чувствительность оказалась достаточно низкой - всего 38%, что свидетельствует об ограниченном значении неполной кишечной метаплазии как показателя прогноза развития рака кишечного типа. Высказывается мнение, что маркером повышенного риска возникновения последнего является не столько тип кишечной метаплазии, сколько площадь замещения желудочного эпителия.

Для выявления подтипов кишечной метаплазии имеет значение присутствие цилиндрических клеток с различными вариантами образования муцинов. При полной кишечной метаплазии муцины не обнаруживаются, типичным же является наличие выраженной щеточной каймы.

В целом замещение одного типа ткани на другой происходит в несколько ступеней. На начальном этапе хронический антральный атрофический гастрит характеризуется тонкокишечной метаплазией. Со временем железы трансформируются в незрелый и позже в зрелый толстокишечный эпителий. Процесс замещения одного вида ткани на другой длится 5–6 лет.

В гистологической классификации опухолей желудка ВОЗ (2000) выделены 2 степени выраженности интраэпителиальной неоплазии: слабая (low-grade) и тяжелая (high-grade). Слабо выраженную интраэпителиальную неинвазивную неоплазию очень трудно отличить от регенерирующего эпителия. Появление высокой степени интраэпителиальной неоплазии - маркер повышенного риска развития и этап морфогенеза РЖ. Последнее поражение рассматривается как внутрислизистая неинвазивная карцинома, которая может выглядеть как плоское (дисплазия) или возвышающееся (аденома) поражение.

Следует отметить, что у пациентов с кишечной метаплазией в зоне пищеводно-желудочного перехода и в пищеводе риск развития рака существенно выше, чем у пациентов с кишечной метаплазией в «некардиальном» отделе желудка.

Продолжим.

На основе комплексного анализа молекулярной информации команда TCGA предложила систему классификации, в которой GC разделен на четыре подтипа: EBV (вирус Эпштейна–Барр)-положительный, микросателлитно-нестабильный, геномно стабильный и хромосомная нестабильность (CIN).
Азиатская группа по исследованию рака (ACRG) в свою очередь описала четыре молекулярных подтипа с различными прогностическими эффектами:
(1) опухоли с высоким MSI, морфологией кишечника и наилучшим прогнозом;
(2) MSS / EMT GC с диффузной морфологией и худшим прогнозом;
(3 и 4) аденокарциномы MSS без сигнатуры EMT, либо TP53-активные (MSS / TP53 +), либо неактивные (MSS / TP53-), и с промежуточным прогнозом. Подтип MSS / TP53- (который примерно соответствует подтипу пролиферации и CIN) встречается часто (36-50% GC) и содержит геномные амплификации TKR (Tyrosine Kinase Receptor), которые представляют собой трансмембранные белки, обладающие сайтами связывания в своих внеклеточных доменах для полипептидных гормонов и факторов роста (лигандов)) и / или RAS, которые используются или являются потенциальными терапевтическими мишенями.

Нарушения эпигенетической регуляции могут способствовать злокачественной трансформации клеток желудка. Инактивация транскрипции метилированием цитозина на промоторных CpG-островках генов репарации несоответствия ДНК (MMR) или генах-супрессорах опухолей является важным механизмом, способствующим развитию нескольких видов рака у человека. Например, гиперметилирование промоторной области hMLH ( гена репарации ошибочного спаривания гомолога ДНК) нарушает регуляцию механизмов репарации ДНК, что приводит к фенотипу микросателлитной нестабильности (MSI), что можно наблюдать, сравнивая микросателлитные локусы в опухолевой и нормальной ДНК.

Нестабильность генома - ключевой клеточный процесс, при котором клетки приобретают мутации с повышенной скоростью, что способствует накоплению мутаций, что в конечном итоге приводит к онкогенезу. Нестабильность генома может быть вызвана мутациями в генах, обеспечивающих уход за ДНК, которые участвуют в обнаружении и восстановлении повреждений ДНК. Например, TP53 и BRCA2 - два ключевых гена-драйвера, которые часто мутируют в GC: TP53 представляет собой ген- супрессор опухоли, кодирующий фактор транскрипции p53, который регулирует гены остановки роста. Мутации в p53 отменяют обнаружение клетками повреждения ДНК, что приводит к аберрантному росту клеток. Точно так же BRCA2 участвует в репарации двухцепочечных разрывов ДНК.

Два фенотипа для геномной нестабильности являются общепринятыми при GC : фенотип, ассоциированный с микросателлитной нестабильностью (МSI), и фенотип, связанный с хромосомной нестабильностью (CIN). Эти фенотипы не являются независимыми и в некоторых случаях могут накладываться друг на друга.

Анеуплоидия ДНК наблюдалась уже во внутрислизистых GC диаметром менее 5 мм, а также в ранних GC. Сходным образом, изменения числа копий были обнаружены в предшественниках GC, a MSI был идентифицирован при кишечной метаплазии, аденоме желудка и ранней GC. Изменения числа соматических копий (SCNA) включают структурные вариации в ДНК, которые возникают из-за изменений числа копий ДНК; SCNA могут включать фокальные области генома или широкие хромосомные области ДНК. В GC специфические SCNA связаны с гистологическим типом. Увеличение числа копий на 8q, 17q и 20q связано с кишечным GC, тогда как прирост на 12q и 13q связано с диффузным GC; так, увеличение 1q, и потеря 18q связаны с плохим прогнозом.

GC демонстрируют частые амплификации в генах сигнального пути RTK / RAS / MAPK , и амплификации генов ERBB2 , EGFR , MET , FGFR2 и KRAS используются для классификации GC на пять подгрупп, что позволяет индивидуализировать лечение каждой подгруппы различными препаратами. Например, на ERBB2 , EGFR , MET и FGFR2 могут быть нацелены лекарства трастузумаб, нимотузумаб, онартузумаб и AZD4547 соответственно. По сути, 37% популяции GC потенциально можно лечить препаратами, нацеленными на этот путь.

Гены PD-L1 и PD-L2 (ингибиторы иммунных контрольных точек), часто амплифицируются в подгруппе EBV-положительных форм рака. Также сообщается о ко-амплификации генов, связанных с клеточным циклом, с другими онкогенами. Например, CCNE1 (Cyclin E1) часто коамплифицируется с HER2 и пациенты с GC с коамплификацией CCNE1 / HER2 обычно развивали устойчивость к лапатинибу, низкомолекулярному ингибитору HER2.

KLF5 , GATA4 и GATA6 существуют в одном комплексе и действуют совместно как онкогены «выживания клонов», способствуя пролиферации клеток; 30% пациентов с ГК показали их амплификацию. При этом KLF5 физически взаимодействует с факторами GATA, поддерживая кооперативную регуляцию KLF5 / GATA4 / GATA6 на совместно оккупированных генах; истощение и сверхэкспрессия этих факторов, по отдельности или в комбинации, уменьшали и способствовали пролиферации рака, соответственно. Отметим, что Krüppel-подобные факторы (Klf) 4 и 5 являются двумя близкородственными членами семейства Klf, которые, как известно, играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла, репрограммировании соматических клеток и плюрипотентности.

HNF4α (Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha) совместно регулируется этими тремя факторами транскрипции, и на него может действовать антидиабетический препарат метформин. HNF4α может негативно регулировать «метаболический переключатель», характерный для общего злокачественного фенотипа. Этот метаболический переключатель делает упор на производство промежуточных продуктов для роста и деления клеток, и он регулируется как онкогенами, так и генами-супрессорами опухолей в ряде ключевых путей образования рака.

Путь AMPKα-HNF4α-WNT5A активируется в тканях ранней стадии GC. HNF4α подавляется сигнальной передачей AMPKα и агонистом AMPK метформином; блокада активности HNF4α приводит к подавлению регуляции циклина, остановке клеточного цикла и ингибированию роста опухоли. HNF4α регулирует передачу сигналов WNT через свой целевой ген WNT5A, потенциальный прогностический маркер опухолей желудка диффузного типа.

Потеря гетерозиготности (LOH) или делеция генома - еще один маркер CIN, который часто наблюдается при GC. Геномные делеции могут вызывать потерю генов-супрессоров опухолей, и степень потери генома может иметь прогностическое значение. Например, исследования LOH классифицировали GC на два подтипа: LOH высокого уровня (LOH-H) коррелирует с GC кишечного или смешанного типа, тогда как низкий уровень LOH (LOH-L) коррелирует с GC диффузного типа. Изменение с LOH-L на LOH-H указывает на увеличение CIN во время развития GC на более поздней стадии.

Транслокации, амплификации и перестройка хромосом также могут приводить к образованию химерных генов или генов слияния. Выявлен ген слияния CD44 - SLC1A2 , который возникает из-за хромосомной точки разрыва в SLC1A2, возникающей в результате геномной инверсии. Этот химерный белок может способствовать развитию GC за счет изменения метаболических путей. Также сеть TCGA сообщила об открытии слитого гена CLDN18-ARHGAP26 , возникающего в результате межхромосомной транслокации и в основном встречающегося в геном-стабильных / диффузных GC. Экспрессия CLDN18-ARHGAP26 в эпителиальных клетках желудка приводит к эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT).

Продолжим.

MSI ( микросателлитная нестабильность ) выявляется до 44% случаев при раке желудка, чаще при кишечной форме и связана с гиперметилированием. Наиболее ее заметным эффектом является мутация рецептора TGF-β ( трансформирующего фактора роста ), снижающая его росттормозящие и проапоптические эффекты. Впрочем, на поздних стадиях он вносит существенный вклад в формирование инвазивного фенотипа.
У пациентов с фенотипом MSI определяется высокая частота ошибок репликации (replication errors) в результате вставок/делеции нуклеотидов в микросателлитных повторах, которые возникают вследствие дефектов системы репарации неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). Инактивация или дефицит одного или нескольких генов MMR (вследствие мутаций или эпигенетических изменений), в частности, MLH1 или MSH2, индуцирует развитие MSI-фенотипа, что приводит к дополнительным мутациям, или нарастанию генетической нестабильности и развитию опухоли.

В целом в случаях с высоким уровнем MSI мутациям подвергается одновременно множество генов-мишеней, отвечающих за клеточный цикл и апоптоз, при этом микросателлитные нестабильные (MSI) GC демонстрируют меньше хромосомных аберраций, чем микросателлитно-стабильные (MSS) раки.

Помимо нестабильности генома, ремоделирование хроматина также становится важным клеточным путем в развитии рака. Изменения в структуре хроматина клетки могут повлиять на доступность ДНК для регуляторов транскрипции, которые существенно влияют на экспрессию генов. Так, ARID1A кодирует субъединицу комплекса ремоделирования хроматина SWI-SNF и был идентифицирован как часто мутирующий ген ремоделирования хроматина в GC. SWI-SNF участвует в ремоделировании нуклеосом АТФ-зависимым образом, чтобы либо активировать, либо репрессировать транскрипцию генов. Было высказано предположение, что ARID1A действует как супрессор опухолей и подавляет гены клеточного цикла, такие как CCNE1 и E2F1.

В соответствии с его функцией супрессора опухолей, мутации ARID1A в GC распределены по всей кодирующей области и обычно инактивируют его, включая усекающие мутации и вставки / делеции, приводящие к изменениям рамки считывания. Кроме ARID1A , другие сложные члены SWI-SNF ( ARID1B , PBRM1 и SMARCC1 ), что также было установлено, мутировали в GC. Кроме того, обнаружены мутации других комплексов ремоделирования хроматина, таких как комплекс MLL ( MLL2 и MLL3 ), комплекс ISW1 ( SMARCA1 ) и комплекс NuRD ( CHD3 , CHD4 и MBD2 ), а также генов, кодирующих гистон-модифицирующие белки ( SIRT1 и SETD2 ).

Гены клеточной адгезии, цитоскелета и клеточной подвижности (например, FAT4 , CDH1 , CTNNA1 и RHOA ) также мутируют в GC, особенно GC диффузного типа Такие гены функционируют, чтобы регулировать межклеточные и внутриклеточные взаимодействия, и нарушения функции этих генов могут играть ключевую роль в развитии и прогрессии GC. Например, FAT4 является опухолевым супрессором, принадлежащим к семейству кадгеринов, и было показано, что мутации FAT4 нарушают прикрепление клеток к матриксу.

CIMP ( фенотип метилирования островков CpG c глобальным гиперметилированием генома, приводящий к отключению генов-супрессоров опухоли ) присутствует в 15% кишечной метаплазии и 50% аденом. Вообще, метилирование CpG островков может считаться третьим молекулярным фенотипом GC, и гены, имеющие отношение к развитию опухоли, такие как APC ( (аденоматозного полипоза толстой кишки), CDH1, MHL1, CDKN2A, CDKN2B и RUNX3, часто подвергаются метилированию. Причиной инактивации генов CDKN2A, CDH1 и MLH1 чаще является именно метилирование промотора, а не мутации.

RUNX3 – это ген, кодирующий белок, относящийся к семейству транскрипционных факторов, содержащих Runt-домен. Гетеродимер этого домена и бета-субъединицы образуют комплекс, который связывается с основной последовательностью ДНК 5'-PYGPYGGT-3', обнаруженной в ряде энхансеров и промоторов, и может активировать или подавлять транскрипцию. При GC часто наблюдается потеря экспрессии этого гена, в основном из-за гемизиготной делеции (при анэуплоидиях) или гиперметилирования. Этот ген экспрессирован только у 45–50 % пациентов с GC, позитивно регулирует экспрессию BIM и p21 и негативно – сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), что сказывается на апоптозе, задержке роста клеток и ангиогенезе. Потеря или существенное снижение экспрессии RUNX3 протеина при РЖ значимо ассоциировано с низкой выживаемостью.

При раке желудка гиперактивированы онкогены EGF, Erb-B2, Erb-В3. Все 3 онкогена – эпидермальные факторы роста – полипептиды, функционирующие как сигналы, стимулирующие пролиферацию опухолевых клеток. Выраженная гиперэкспрессия этих онкогенов, отмечаемая при кишечной форме рака желудка, является индикатором плохого прогноза даже при высокой дифференцировке опухолей. Показано, что антитела к гену Егb-В2 тормозят рост опухолевых клеток.
RHOA принадлежит к семейству Rho, которое функционирует в регуляции актинового цитоскелета, и было показано, что мутации в этом гене придают большую устойчивость к аноикису (разновидность апоптоза) после отслоения от субстрата. Остатки Tyr42, Arg5 и Gly17 являются горячими точками мутации RhoA, обнаруженными в GC.

Мутация супрессорных генов Р53, МСС (мутантный белок колоректального рака, как полагают, отрицательно регулирует развитие клеточного цикла, ингибируя переход в S-фазу), АРС регистрируется у 30-65% больных раком желудка, обычно при кишечной форме. G-17 гастрин – фактор роста, продуцируемый слизистой желудка; как оказалось, он является транскрипционным активатором гепарин связанного эпидермального фактора роста (Heparin binding epidermal growth factor HB-EGF), который усиливает опухолевую пролиферацию.

COX-2 является ключевым ферментом, участвующим в образовании простагландинов из арахидоновой кислоты, а также вовлечен в процесс канцерогенеза. В ткани опухоли простагландины усиливают пролиферативную активность, способствуют ангиогенезу и метастазированию. Показана корреляция между экспрессией COX-2 и VEGF, что говорит об усилении процессов ангиогенеза в этой группе опухолей.

Выявлено двукратное ускорение прогрессирования GC при наличии гомозиготного генотипа 1195AA гена COX-2 в сравнении с гетерозиготным генотипом или гомозиготным по G аллелю, а у носителей АА генотипа экспрессия COX-2 выше, чем у носителей GG генотипа: при этом ткани, инфицированные H. pylori могут стимулировать активность COX-2 промотора, особенно в присутствии А аллеля. В целом отмечена экспрессия COX-2 в высоко- и умеренно дифференцированных карциномах интестинального типа, а также в предшествующих раку изменениях, таких как дисплазия эпителия и кишечная метаплазия

Вставка.

Метаболическое перепрограммирование при раке желудка

Hp-инфицированные эпителиальные клетки желудка демонстрируют повышенный гликолиз и повышенную экспрессию Lon протеазы 1 (Lonp1), белка, который активирует митохондриальный ответ развернутого белка и поддерживает функцию митохондрий. Дело в том, что после синтеза на цитозольных рибосомах ядерно-кодированные митохондриальные предшественники импортируются в органеллы в их развернутом состоянии из-за ограниченного размера пор митохондрий. Следовательно, после импорта митохондриальные предшественники должны эффективно складываться в свою функциональную структуру, чтобы избежать агрегации из-за воздействия на гидрофобные поверхности. Кроме того, LONP1 осуществляет протеолиз неправильно собранных и поврежденных белков матрикса митохондрий.

Также ассоциированный с цитотоксином ген A (CagA) усиливает экспрессию PKM2 и пируватдегидрогеназы киназы (PDK1). Более того, когда CagA локализуется в митохондриях, он ингибирует активность сиртуина 3 (SIRT3) и способствует стабильности индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α). С другой стороны, вакуолизирующий цитотоксин A (VacA) является другим белком Hp, и он вызывает митохондриальную дисфункцию, способствует митохондриальному делению и уменьшает количество копий митохондриальной ДНК (мтДНК). Взятые вместе, эти данные подтверждают модель, в которой Hp индуцирует GC, способствуя гликолизу и дисфункции митохондрий.

У 62,5% пациентов с GC были обнаружены мутации в митохондриальных генах. Уменьшение количества копий мтДНК также наблюдалось у 54,8% пациентов с GC, особенно у пациентов с прогрессирующим GC. Репликация мтДНК требует топоизомеразы, за исключением митохондриальной топоизомеразы I (TOP1MT). Последний оказывает негативное влияние на регуляцию репликации мтДНК, но играет важную роль в формировании и поддержании областей D-LOOP мтДНК и в поддержании митохондриального гомеостаза. Таким образом, низкие уровни TOP1MT обычно выражены в GC, при этом экспрессия LDHA и гликолиз также увеличивается в отсутствие TOP1MT.

SIRT3 локализуется в митохондриях и в основном участвует в регуляции окислительного стресса. Однако было также показано, что SIRT3 активирует марганецзависимую супероксиддисмутазу, ингибирует уровни митохондриальных АФК, регулирует ответ развернутого белка митохондрий и поддерживает митохондриальный гомеостаз. Таким образом, SIRT3 считается геном-супрессором опухоли.

Профиль гликолиза GC является уникальным и основан на способности клеток GC поддерживать их рост в условиях гипоксии, обеспечивать сырьем для биосинтеза и деления клеток и поддерживать внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз.
Следующие шесть белков были идентифицированы как ключевые гликолитические ферменты, на которые влияет метаболическое перепрограммирование в GC:

1. Гексокиназа II
Семейство белков гексокиназы (HK) катализирует превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат (G6P) в качестве первого ограничивающего скорость этапа гликолиза. G6P также участвует в пентозофосфатном пути и процессе глюконеогенеза. Было установлено, что среди белков семейства HK HKII постоянно сверхэкспрессируется в большинстве опухолей, включая GC. В опухолевых клетках HK2 играет критическую роль в фокусной точке двух центральных путей контроля гликолиза - путей c-Myc и индуцируемого гипоксией фактора 1-альфа (HIF1α), чтобы обеспечить опухолевые клетки энергией и метаболическими соединениями для синтеза нуклеотидов и белков.

HKII связывается с зависимыми от напряжения анионными каналами (VDAC) на внешней мембране митохондрий для получения АТФ, необходимого для гликолиза. Однако HKII также может напрямую связываться с внешней мембраной митохондрий (OMM), в частности, через антиапоптотический белок Bcl-2 и проапоптотический белок Bax, чтобы ингибировать апоптоз. Так, связывание HK2 с VDAC является ключевым событием в антиапоптозе опухолевых клеток, которое помогает уменьшить образование переходных пор проницаемости (PTPs) в OMM и предотвращает последующее высвобождение проапоптотических белков, таких как цитохром с.

Таким образом, HKII является отличной мишенью для блокирования потока глюкозы. На сегодняшний день в клинике было разработано несколько стратегий нацеливания на HK2, включая прямую репрессию HK2, такую ​​как 3-бромпируват и лонидамин, а также косвенное подавление HK2, такое как подходы РНК-интерференции и подавление комплексов VDAC-HK. Так, активность гликолиза снижается, когда байкалеин ингибирует HKII, PDK1 и LDHA, а таже он снижает устойчивость клеток аденокарциномы желудка к фторурацилу. Кроме того, солодковый халкон A является новым ингибитором HKII, а также ингибитором пути AKT, который снижает потр***ение глюкозы и выработку лактата в клетках GC, причем последнее состояние вызывает апоптоз.

2. Пируваткиназа М2
Пируваткиназа (РК) является ключевым ферментом на конечной стадии гликолиза, который катализирует превращение фосфоенолпирувата в пируват. Есть четыре члена семейства белков PK, PKM1, PKM2, PKL и PKR. PKM1 и PKM2 кодируются PKM , тогда как PKL и PKR кодируются геном PKLR. Кроме того, PKM1 проявляет высокую активность PK, а PKM2 - нет. Опухолевые клетки обычно экспрессируют высокие уровни PKM2 и низкие уровни PKM1, тем самым способствуя гликолизу и ингибируя митохондриальное окислительное фосфорилирование.
PKM2 может действовать в качестве сенсора аминокислот. В частности, фенилаланин, аланин, триптофан, метионин, валин и пролин способны ингибировать его, а гистидин и серин способны активировать PKM2.

PKM2 могут также транслокациваться в ядро и способствуют транскрипциям HIF-1 и Bcl-XL для дальнейшего повышения гликолиза.
Кроме того, было показано, что взаимодействия между PKM2, β-катенином и октамер-связывающим фактором транскрипции 4 (OCT4) поддерживают стволовые клетки, в том числе раковые. В митохондриях PKM2 взаимодействует с Bcl-2 и активирует его, чтобы ингибировать апоптоз. Также избыточная экспрессия PKM2 способствует слиянию митохондрий, меньшему количеству копий мтДНК, а также подавлению экспрессии и деградации p53. Избыточная экспрессия PKM2, кроме того, снижает уровни цепи переноса электронов сложных белков I, III и V.

3. Пируватдегидрогеназы киназы
Семейство белков PDK включает четыре изоформы. PDK1 обычно экспрессируется на высоких уровнях в опухолях и связан с пролиферацией опухолей, метастазированием и плохим прогнозом. PDK1 ингибирует активность пируватдегидрогеназы (PDH) для стимулирования перехода пирувата в молочную кислоту и помогает регулировать путь AKT / NF-κB. Способность PDK ингибировать активность PDH также приводит к снижению уровня ацетил-КоА, что влияет на синтез липидов de novo.

4. Енолаза
Энолаза (ENO1) катализирует превращение фосфоглицерина в фосфоенолпируват при гликолизе и высоко экспрессируется в GC; сверхэкспрессия ENO1 усиливает пролиферацию и метастазирование клеток GC. ENO1 тесно связан с белком теплового шока бета-1 (также известным как Hsp27) и он влияет на регуляцию антистрессовых путей.

5. Транспортер глюкозы
Как следует из их названия, транспортеры глюкозы (GLUT) 1–4 ответственны за транспорт глюкозы в клетки, а также в GC, где GLUT1 и GLUT4 имеют высокую экспрессию.

6. Транспортер монокарбоновой кислоты
Семейство белков транспортера монокарбоновой кислоты (MCT) имеет 14 членов. В GC MCT1, MCT2, и особенно MCT4, высоко экспрессированы. Эти протонные насосы транспортируют монокарбоновые кислоты, пировиноградную кислоту, молочную кислоту, кетоновые тела и другие вещества для поддержания высокого потока глюкозы. Они также играют важную роль в выживании опухолевых клеток в высококислотных условиях.

При GC уровни липидов и триглицеридов обычно повышаются. Эндоскопические исследования выявили новую ультраструктуру для GC, которая включает в себя белое непрозрачное вещество (WOS). Гистологические исследования показали, что внутренняя часть этого WOS состоит из большого количества липидных капель. Эта новая структура считается отличительной чертой GC, и ее формирование согласуется с наблюдениями, что деградация липидов ингибируется и синтез липидов усиливается.

Между тем, если нарушен липидный обмен, наблюдаются низкие уровни митохондриального окислительного фосфорилирования, и это может быть связано с плохим прогнозом при GC. Кетогенная диета, состоящая из среднего содержания белка, низкого уровня углеводов и обогащенного омега-3 жирных кислот и триглицеридов со средней длиной цепи, приводило к снижению поглощение глюкозы и существенному ингибированию роста GC.

Продолжим.

Аллостерическая регуляция гликолиза придает метаболическую пластичность по отношению к локальному pO2. Поскольку гликолитический поток номинально быстрее, чем у OXPHOS, эволюционно выбран эффект Пастера, чтобы связать обе скорости метаболизма. Энергетические метаболиты глюкоза-6-P, АТФ и цитрат сдерживают гликолитический поток посредством аллостерического ингибирования ключевых гликолитических ферментов. Ингибирование достигает своего апогея, когда кислород не является ограничивающим субстратом для OXPHOS, что позволяет полностью окислить глюкозу. Когда уровни кислорода ограничены или когда pO2 кол***ется, полное окисление глюкозы и, как следствие, уровни АТФ и цитрата, образующихся окислительно, снижаются. Эффект Пастера сбрасывается до менее выраженного ингибирования, что позволяет ускоренному гликолизу компенсировать дефектное производство АТФ.

Экстремальная ситуация, характеризующаяся полным подавлением эффекта Пастера, встречается при тяжелой гипоксии. Энергетический кризис связан с увеличением клеточных уровней фруктозо-1,6-bisР, АДФ, АМФ и неорганического фосфата (Pi). Эти молекулы вызывают серию аллостерических стимулов, которые ускоряют гликолитический поток. Таким образом, гликолиз становится основным источником клеточного производства АТФ, спасательной ситуацией, позволяющей кратковременное выживание клеток до восстановления pO2.

Oпухолевые клетки из-за стремления к безудержному распространению постоянно теряют доступный запас кислорода, вторгаясь в регионы, удаленные от кровеносных сосудов. Рост также связан с ослаблением изначально плотной сосудистой сети. Эти условия составляют исходную почву для установления устойчивой гипоксии опухоли, которая не может быть долгосрочно преодолена единственно подавлением эффекта Пастера. В формирующихся опухолях опухолевые клетки на дальнем краю кислородного градиента имеют две возможные судьбы: смерть или метаболическая адаптация. Гипоксическая смерть - типичный признак спящих опухолей, то есть микроскопических бессимптомных поражений, характеризующихся динамическим равновесием между пролиферацией оксигенированных клеток и гибелью гипоксических. Для сравнения (и, надеюсь, для нас) стойкое переключение на гликолитический метаболизм - редкое событие, знаменующее вступление опухоли в фазу экспоненциального роста.

Во время гипоксии HIF-1α избегает протеолитической деградации, чтобы мигрировать в ядро ​​клетки, где он связывается с HIF-1β (см.выше). Для инициации транскрипции дополнительно требуется взаимодействие HIF-1 с кофакторами p300 и комплексом ДНК-полимеразы II для связывания с элементами, чувствительными к гипоксии (HRE) генов-мишеней. Генные продукты в основном относятся к двум категориям: такие, как
эритропоэтин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS), направленные на восстановление местного pO2; и те, кто участвует в ускорении гликолитического потока.

HIF-1, как я уже упомянул, активно влияет на процесс гликолиза. Так, HK2 связываясь с внешней митохондриальной мембраной, не только тормозит апоптоз, но и приобретает нечувствительность к ингибированию отрицательной обратной связью с помощью G6P, тем самым обеспечивая эффективный захват глюкозы опухолевыми клетками.

Фруктозо-2,6-бисфосфат (F2,6BP) - побочный продукт гликолиза и одновременно его ключевой регулятор, действующий как аллостерический активатор PFK1, одного из ферментов, контролирующих скорость гликолиза. F2,6BP продуцируется из фруктозо-6-фосфата (F6P) семейством гомодимерных ферментов, известных как 6-фосфофрукто-2-киназа / фруктозо-2,6-бисфосфатаза (PFKFB).

PFKFB представляют собой бифункциональные ферменты, которые катализируют либо АТФ-зависимое фосфорилирование F6P до F2,6BP (активность PFK2), либо дефосфорилирование F2,6BP до F6P (активность FBPase). Семейство состоит из четырех членов, среди которых PFKFB1, PFKFB2 и PFKFB4 в базовых условиях проявляют одинаковую активность PFK2 и FBPase , тогда как PFKFB3 имеет высокую активность PFK2 и почти не имеет активности FBPase. Транскрипция всех четырех генов PFKFB индуцируется гипоксией, но основная индукция наблюдается для гена PFKFB3, который является мишенью для HIF-1. Гипоксическая стимуляция активности PFK2 PFKFB3 дополнительно усиливается за счет фосфорилирования остатка серина в положении 462, в процессе с участием AMPK. В результате гликолитический поток приобретает еще одно регулирующее ответвление.

Пируваткиназа (PK) имеет четыре изоформы, из которых PKM1 / M1-PK и PKM2 / M2-PK продуцируются альтернативным сплайсингом транскриптов гена PKM, гена-мишени HIF-1. Альтернативный сплайсинг регулируется гетерогенными ядерными рибонуклеопротеидами (hnRNP) I, A1 и A2 (которые связываются с экзоном 9 и подавляют сплайсинг с PKM1), в свою очередь контролируемых c -Myc. Селекция изоферментов обеспечивает быстрое размножение, наблюдаемое в опухолях.

В отличие от PKM1, PKM2 является характерным изоферментом клеток с высокоскоростным синтезом нуклеиновых кислот, включая нормальные пролиферирующие клетки, эмбриональные клетки, взрослые стволовые клетки, а также, что важно, опухолевые клетки. Во время тканевой дифференцировки в процессе развития эмбриональная PKM2 заменяется тканеспецифичными изоформами. Однако опухолеобразование связано с повторной экспрессией PKM2 вместе с подавлением экспрессии PKM1 и других изоферментов. Эта «гликолитическая дедифференцировка» предлагает ключевое преимущество с точки зрения метаболической пластичности, потому что, в отличие от PKM1 (существующей только в активной тетрамерной форме), PKM2 может экспрессироваться либо как активный тетрамер, либо как димер с низким сродством к фосфоенолпирувату(PEP).

PKM2 в своей высокоактивной тетрамерной конформации обеспечивает в результате гликолиза производство АТФ с высоким выходом, тогда как в своей почти неактивной димерной конформации он обеспечивает метаболическое узкое место, позволяющее перенаправлять гликолитические промежуточные продукты на биосинтез, в частности, подпитка через PPP для синтеза ДНК.

Баланс между тетрамерным и димерным PKM2 - это кол***ющийся феномен, подверженный аллостерической регуляции. Вкратце, тетрамерной активной форме способствует накопление вышестоящего гликолитического промежуточного соединения F1,6BP и побочного продукта биосинтеза серина; инактивирующая димеризация, наоборот, индуцируется, когда концентрация последующих продуктов биосинтеза (аланина, других аминокислот и липидов) увеличивается (см.выше). Димерная конформация дополнительно стимулируется фосфорилированием тирозина 105 несколькими онкогенными тирозинкиназами.

Пируват находится в центре между различными метаболическими путями: он является продуктом гликолиза, продуктом окисления малата в пролиферирующих клетках, основным топливом цикла TCA, предшественником аланина в обратимом трансаминировании, реакции с участием глутамата в качестве донора азота и субстратом окислительно-восстановительной реакции с образованием лактата. Последняя реакция, сочетающая восстановление пирувата с окислением NADH до NAD +, позволяет пополнить пул NAD +, необходимый для самодостаточности гликолиза.

Восстановление пирувата до лактата также позволяет гликолитическим клеткам поддерживать уровни пирувата на достаточно низком уровне; эта обратимая реакция катализируется семейством тетрамерных ферментов ЛДГ. LDH образуются путем расположения до четырех копий двух различных субъединиц: субъединица LDH-H кодируется геном LDH-B и повсеместно экспрессируется в здоровых тканях, тогда как субъединица LDH-M кодируется HIF-1-мишенью - геном LDH-A и, следовательно, индуцируется гипоксией.

Расположение субъединиц с образованием активных тетрамеров может привести к образованию пяти различных ферментов, от LDH1 до LDH5. LDH5 / LDH-4M предпочтительно катализирует восстановление пирувата в лактат и играет ключевую роль в поддержании высокого гликолитического потока и устойчивости к апоптозу. LDH1 / LDH-4H предпочтительно катализирует окисление лактата в пируват, а LDH2, LDH3 и LDH4 обладают промежуточной ферментативной активностью. Повышенная экспрессия LDH5 имеет н***агоприятное прогностическое значение для многих опухолей человека. Напротив, LDH1 / LDH-4H чаще всего подавляется в гликолитических раковых клетках.

Продолжим.

Пируватдегидрогеназа (PDH), фермент, заставляющий пируват вступать в цикл TCA, подвергается фосфорилирующему ингибированию PDK1. PDK1 контролирует митохондриальную активность: при активации предотвращает попадание пирувата в цикл TCA; в неактивном состоянии пируват превращается в ацетил-коА и может служить предшественником для производства катаплеротических продуктов цитрата и изоцитрата (инициируя биогенез липидов), глутамата (генерирующего глутамин) и малата (для производства НАДФН и пирувата через яблочную кислоту). При этом НАДФН, продуцируемый либо из PPP, либо из малата, выполняет две основные функции: он является необходимым кофактором для липогенеза (стадия HMG-CoA редуктазы) и используется в качестве восстановителя для регенерации глутатиона (GSH) из его окисленной дисульфидной формы. (GSSG). Как антиоксидант, GSH выводит токсины на АФК.

В условиях гипоксии ингибирование PDH преследует две основные цели: ориентировать пируват на реакцию LDH5 для производства НАД + и предотвратить чрезмерное производство активных форм кислорода (АФК) митохондриями. В самом деле, хотя кислород является основным акцептором электронов, производимых дыхательной цепью, электроны передаются воде, чтобы произвести ROS, когда кислорода не хватает. Как продукт гена-мишени HIF-1, PDK1 связывает гипоксию с ослаблением активности дыхательной цепи. Подобно HK2, было показано, что HIF-1 кооперируется с c-Myc для трансактивации PDK1. Высокая экспрессия PDK1 сильно коррелирует с плохим исходом рака головы и шеи.

Реакция LDH5 дает эквимолярные концентрации лактата (из пирувата) и протонов (из NADH). Чтобы избежать внутриклеточного закисления и гибели, гликолитические клетки должны экспортировать протоны. Некоторые системы адаптированы для транспорта протонов, среди которых MCT1, MCT2, MCT3 и MCT4 являются пассивными лактат-протонными симпортерами. MCT4 (Km лактат = 22 мМ) имеет самое низкое сродство к лактату, кодируется геном-мишенью HIF-1 и поэтому адаптирован для экспорта молочной кислоты из гликолитических опухолевых клеток. Он играет важный вклад в регуляцию внутриклеточного pH (pHi): хотя он имеет только низкое сродство к лактату, его высокая скорость обмена обеспечивает эффективный экспорт протонов.

MCT1 (Km лактат = 3,5–10 мМ) имеет промежуточное сродство к лактату и повсеместно экспрессируется в здоровых и раковых тканях. При раке он способствует поглощению лактата окислительными опухолевыми клетками в недавно описанном метаболическом пути, включающем окисление лактата в пируват, чтобы подпитывать цикл TCA . MCT2 (Km лактат = 0,5 мМ) и MCT3 (Km лактат = 5 мМ) имеют самое высокое сродство к лактату и специализируются на импорте лактата в специфические ткани, такие как печень (цикл Кори), почки и сетчатка. Недавно было показано, что высокая экспрессия как MCT1, так и MCT4 коррелирует с инвазивностью клеток рака легких.

Метаболический симбиоз предложен в качестве обоснования эффективной доставки глюкозы в компартмент гипоксических опухолевых клеток. Он основан на обмене лактата: гипоксические / гликолитические опухолевые клетки производят лактат, а нормоксические / окислительные опухолевые клетки потр***яют лактат окислительно. Последний процесс включает окисление лактата в пируват с помощью LDH1.
Ядром симбиоза является метаболическое предпочтение оксигенированных опухолевых клеток лактата по сравнению с глюкозой в качестве окислительного топлива, что, как следствие, улучшает распределение глюкозы по областям гипоксической опухоли. Обоснование метаболического предпочтения включает конкуренцию между LDH1 и гликолитическим ферментом GAPDH за NAD + (LDH1 является более эффективным путем в сочетании с тем фактом, что лактат ингибирует активности HK и PFK1. В симбиотической модели MCT4 служит для экспорта лактата из гликолитических опухолевых клеток, а MCT1 является основным помощником поглощения лактата окислительными опухолевыми клетками.

В то время как HIF-1 эволюционировал для облегчения производства энергии посредством гликолиза в условиях гипоксии, c-Myc, напротив, способствует биогенезу митохондрий в нормоксических условиях. Оба пути являются взаимоисключающими в нормальных клетках, но во многих опухолях, однако, обнаружено, что c-Myc сверхэкспрессируется следствие амплификации генов, измененного контроля транскрипции и хромосомной транслокации.

Поскольку мРНК HIF-1α содержит полипиримидиновые участки, обычно считается, что PI3K / Akt / mTOR стимулирует кэп-зависимую трансляцию мРНК HIF-1 посредством активации двух нижестоящих мишеней mTOR, p70S6K и 4E-BP1; здесь активация HIF-1α опосредуется VHL-независимым путем. Поскольку индукция активности HIF-1, по-видимому, играет решающую роль в метаболизме рака, ингибирование HIF-1 было вовлечено в блокирование роста и прогрессирования опухоли.

Любая пролиферирующая клетка в организме подвергается метаболическому переключению, в первую очередь состоящему из разъединения цикла TCA и OXPHOS. Таким образом органические кислоты, такие как цитрат, изоцитрат и малат, могут просачиваться из митохондрий. При этом самоавтономный аэробный гликолиз является неотъемлемой частью пролиферативного фенотипа рака.

В процессе канцерогенеза основные факторы плюрипотентности OCT4, SOX2 и Nanog занимают многие регионы генов гликолитических ферментов и участвуют в прямой транскрипционной регуляции гликолиза. Недавнее исследование показало важную роль некодирующей РНК, Lncenc1, для экспрессии связанных с гликолизом генов. Удаление гена Lncenc1 снижает потр***ение глюкозы и продукцию лактата более чем на 50%, что указывает на нарушение гликолиза. Lncenc1 взаимодействует с двумя РНК-связывающими белками, полипиримидиновым белком, связывающим тракт 1 (PTBP1) и гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином K (HNRNPK), оба из которых регулируют экспрессию гликолитических генов для поддержания способности раковых клеток к самообновлению. Поскольку комплекс, содержащий Lnecn1, PTBP1 и HNRNPK, занимает промоторные области генов гликолиза, Lncenc1, PTBP1 и HNRNPK могут напрямую усиливать транскрипцию этих генов.

Митохондрии в гипоксических раковых клетках имеют глобулярную форму, а их кристы слабо развиты и незрелы, что может использоваться как индикатор начинающейся плюрипотентности. Отмечается низкое количество копий митохондриальной ДНК, а митохондрии обычно локализуются в перинуклеарной области. Кроме того, мутация erv1-подобного фактора роста увеличивает экспрессию ГТФазы, связанной с динамином 1 (Drp1), фактором, который участвует в делении митохондрий, что затем вызывает крайнее деление митохондрий.

Несвязанный белок 2 (UCP2) шунтирует пируват из митохондрий, тем самым смещая производство АТФ от OxPhos к гликолизу. Кроме того, UCP2 отделяет ETC от производства АТФ, предположительно для того, чтобы уменьшить образование активных форм кислорода (ROS). Известно, что OxPhos в митохондриях генерирует АФК, которые потенциально могут повредить белки, липиды и нуклеиновые кислоты в клетках. Благодаря UCP2, ESCs поддерживают продукцию ROS на низком уровне и обладают относительно низкими уровнями окисленных белков, липидов и ДНК.

Несвязанный белок 2 (UCP2) в ESCs шунтирует пируват из митохондрий, тем самым смещая производство АТФ от OxPhos к гликолизу. Кроме того, UCP2 отделяет ETC от производства АТФ, предположительно для того, чтобы уменьшить образование активных форм кислорода (ROS). Известно, что OxPhos в митохондриях генерирует АФК, которые потенциально могут повредить белки, липиды и нуклеиновые кислоты в клетках. Благодаря UCP2 продукция ROS поддерживается на низком уровне и клетки обладают относительно низкими уровнями окисленных белков, липидов и ДНК. Во время первой стадии онкогенеза UCP2 подавляется, что, вероятно, способствует увеличению АФК и геномной нестабильности, в то время как он запускается и сверхэкспрессируется на более поздних стадиях развития рака, вызывая устойчивость злокачественных клеток к терапии и агрессивность опухоли в основном за счет антиапоптотических механизмов, индуцированных ослаблением продукции АФК.

Продолжим.

Несвязанные белки (UCPs) представляют собой митохондриальные белки-переносчики анионов, локализованные во внутренней мембране митохондрий. В настоящее время у млекопитающих идентифицировано пять членов семейства UCP. Среди них UCP2 широко распространен по всему организму, что предполагает различные и широкие функции этого митохондриального разобщающего белка. В основном, антиоксидантная роль UCP2 обусловлена ​​его способностью снижать митохондриальный потенциал и рассеивать протонный градиент. Это предотвращает чрезмерное увеличение протонодвижущей силы, тем самым уменьшая количество активных форм кислорода (АФК), особенно супероксид-ионов, образующихся в результате утечки электронов из транспортной цепи митохондрий.

UCP2 - это чувствительный к окислительно-восстановительному потенциалу белок, функционирующий как митохондриальный окислительно-восстановительный датчик. В результате окисления UCP2 активируется, становясь важным компонентом механизмов антиоксидантной обратной связи, обычно участвующих в цито-защитных событиях, контролирующих выработку митохондриальных ROS и регулирующих окислительно-восстановительные цитозольные сигнальные пути.

Антиоксидантную функцию UCP2 можно рассматривать как перекресток между эффектом Варбурга и регуляцией аутофагии в раковых клетках.Вообще, эффект Варбурга можно рассматривать как метаболическую адаптацию раковых клеток, несущих митохондрии с дефицитом антиоксидантов. В межмембранном пространстве митохондриального матрикса канал, образованный этими белками, может также способствовать оттоку из митохондрий в сторону цитозоля пирувата и промежуточных продуктов цикла Кребса, тем самым ограничивая митохондриальное окисление глюкозы и поддерживая эффект Варбурга (см. выше).

UCP2 опосредует цитозольную стабилизацию гликолитического фермента глицеральдегида-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH). ROS, продуцируемые ингибированием UCP2, способны стимулировать окисление этого гликолитического фермента, определяя его конформационные изменения, которые способствуют его транслокации в ядро, где он может впоследствии активировать экспрессию GAPDH-регулируемых генов, таких как решающий аутофагический ген Atg12. Также сверхэкспрессия UCP2 активирует фосфофруктокиназу 2 / фруктозо-2,6-бисфосфатазу 2 (PFKFB2), тем самым усиливая гликолиз (см. выше). Напротив, siRNA-опосредованное ингибирование PFKFB2 вызывает заметное снижение гликолиза, пролиферации и трансформации клеток в сверхэкспрессируемых UCP2 клетках.

Опухолевые стволовые клетки (ОСК)

Раковые клетки имеют много общего с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Например, агрессивный рак и ESC имеют общую сигнатуру экспрессии генов, которая включает сотни генов. Поскольку гены ESC не присутствуют в большинстве тканей взрослого человека, они могут быть идеальными кандидатами-мишенями для диагностики и лечения рака. Так, SALL4, член семейства spalt-подобных (SALL) генов (от SALL1 до SALL4) играет важную роль в поддержании плюрипотентных и самообновляющихся свойств эмбриональных стволовых клеток (ESC). После рождения экспрессия SALL4 подавляется и отсутствует в большинстве тканей взрослого человека. Однако SALL4 повторно экспрессируется при различных формах рака. Так, в солидных опухолях SALL4 был впервые изучен в опухолях зародышевых клеток, например, опухолей семенных клеток яичка и злокачественных зародышевых опухолей яичников.

SALL4-положительные клетки HCC имеют паттерн экспрессии генов, подобный паттерну экспрессии фетальных печеночных клеток-предшественников. Эти ГЦК имеют тенденцию быть более агрессивными и связаны с плохим прогнозом. PTEN был идентифицирован как ключевой нижестоящий целевой ген для SALL4, который напрямую взаимодействует с репрессорным комплексом NuRD и рекрутирует его в промоторную область PTEN. Что касается гликолиза, то нокдаун SALL4 приводит к ингибированию поглощения глюкозы и активности HK-2.

Согласно теории ОСК, основная масса опухоли состоит из множества гетерогенных дифференцированных раковых клеток, подпитываемых редкой популяцией ОСК (от 1% до 10%), характеризующихся способностью к самообновлению и дифференцировке. Основная регуляторная сеть для поддержания и самообновления эмбриональных стволовых клеток OCT4, SOX2, KLF4, NANOG и SALL4 аномально экспрессируются в образцах опухолей человека, что свидетельствует о наличии раковых стволовых клеток. Фактор транскрипции Zscan4 также связан с фенотипом стволовых клеток в плоскоклеточной карциноме головы и шеи человека (HNSCC); его сверхэкспрессия связана с повышенным гиперацетилированием гистона 3 на промоторах NANOG и OCT4.

Способность к развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) у ОСК связана с активизацией транспортеров аденозинтрифосфат-связывающей кассеты (ABC), которые представляют собой насосы оттока, экспрессирующиеся на высоком уровне на мембране клеток-предшественников, и отвечают за защиту популяции стволовых клеток от токсичных молекул. Кроме того, после медикаментозного лечения другие молекулярные пути могут действовать в поддержании выживания РСК. Так, аутокринная передача сигналов VEGF / VEGFR-1 (Flt) активируется в субпопуляции высоко онкогенных клеток в ответ на лечение цисплатином (CDDP) и характеризуется экспрессией генов плюрипо -тентности OCT4, NANOG и BMI1.

WNT регулирует киназу пируватдегидрогеназы, PDK1, путем фосфорилирования и инактивации ферментного комплекса пируватдегидрогеназы (PDH), ответственного за превращение пирувата в ацетил-КоА. Уменьшение входа ацетил-КоА в ТСА и окисли -тельного фосфорилирования приводит к снижению митохондриального дыхания и, следовательно, к снижению уровней АФК. Передача сигналов Notch1 также играет роль в регуляции метаболизма в ОСК. В частности, при связывании с лигандом Jagged1 Notch1 активирует нижестоящий каскад, который посредством взаимодействия с PTEN-индуцированной киназой 1 (PINK1) приводит к активации mTORC2 / AKT, что в свою очередь, фосфорилирует SOX2 и OCT4 и, следовательно, положительно способствует поддержанию стволовости. mTORC2 также участвует в репрессии FoxO3, фактора транскрипции, который отвечает за ингибирование гликолитического пути.

Стволовые клетки рака желудка (GCSC) демонстрируют отчетливую экспрессию нескольких поверхностных маркеров. К ним относятся: CD44 (кластер дифференцировки 44), EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток), LGR5 (богатый лейцином, содержащий повторы, рецептор 5, связанный с G-белком), ALDH1 (альдегиддегидрогеназа 1), CD133 и SOX2. Степень выраженности этих маркеров связана с инвазией сосудов и лимфатических узлов, размером опухоли и ответом на химиотерапевтические препараты.

Экзогенная абсорбция или эндогенный синтез липидов играет важную роль в поддержке самообновления ОСК во время процесса туморогенеза. Так, ингибирование АТФ-цитратлиазы, фермента, ответственного за превращение цитозольного цитрата в ацетил-КоА, приводит к подавлению транскрипционного фактора Snail, ключевого регулятора фенотипа стволовости раковых стволовых клеток. FASN, ключевой липогенный фермент, который превращает ацетил-КоА и малонил-КоА в пальмитат, резко активируется при многих раковых заболеваниях. Ингибирование активности FASN церуленином вызывает регресс в образовании опухолевых сфер со снижением экспрессии маркеров стволовости, таких как нестин и CD133, и увеличением экспрессии маркеров дифференцировки.
Вообще, ОСК поддерживают свою стволовость, синтезируя большее количество мононенасыщенных липидов (МНЖК). Этот процесс опосредуется специфическими ферментами, такими как стеароил-КоА-десатураза-1 (SCD1), которая при раке желудка активируется, что приводит к плохому прогнозу.

Nanog, маркер стволовых клеток, перепрограммирует метаболизм опухолевых стволовых клеток (TIC), подавляя экспрессию генов OXPHOS и активируя окисление жирных кислот (FAO). Подавление СРТ1, фермента, ограничивающего скорость FAO, снижает устойчивость к 5-ФУ и оксалиплатину.

Продолжим.

FA обеспечивают еще один путь топлива для CSC. Экспрессия транслоказы FA (также известная как CD36), которая способствует захвату липидов, коррелирует с плохим прогнозом при различных формах рака, а CD36 считается маркером стволовых клеток в опухолях груди, головного мозга и жировой ткани.

Наряду с метаболизмом жирных кислот, метаболизм холестерина также является признаком рака. В частности, увеличение уровней SREBP2, фактора транскрипции, ответственного за биосинтез и гомеостаз холестерина, коррелирует с увеличением основной массы опухолевых стволовых клеток. Глутамин в раковых стволовых клетках используется в качестве основного источника азота, поскольку он представляет собой хороший донор восстановленного азота для создания пуриновых и пиримидиновых оснований, а также белков.

Кетоновые тела используются в качестве субстрата для производства энергии в раковых стволовых клетках, поскольку они превращаются в ацетил-КоА, который входит в цикл TCA, обеспечивая углерод для производства энергии. Было обнаружено, что новый класс соединений, названных «митокетосцины», нарушает это преобразование, что приводит к ингибированию пролиферации стволовых клеток рака груди.

Выявлена связь между низкими уровнями внутриклеточных АФК и стволовостью рака. Глутатион (GSH) - это антиоксидантный пептид, который широко представлен в митохондриях эукариотических клеток. GSH участвует в поддержании окислительно-восстановительного баланса посредством детоксикации АФК и в защите фосфолипидов в митохондриальной мембране. Высокие уровни внутриклеточного GSH могут быть обусловлены высокой активностью переносчика плазматической мембраны xCT, субъединицы переносчика цистин-глутаматного обмена, который участвует в захвате цистеина, необходимого для синтеза GSH. Интересно, что высокие уровни глутатиона обнаружены в эмбриональных и мезенхимальных стволовых клетках, где они отвечают за поддержание стволовости. Точно так же высокие уровни GSH вместе с GSH-связанными ферментами обнаруживаются в ОСК желудка, печени и рака груди. ОСК поджелудочной железы демонстрируют высокий уровень содержания GSH и активацию нескольких генов, участвующих в передаче сигналов GSH.

Продукция АФК индуцирует активацию киназы ASK1 (Apoptosis signal-regulating kinase 1), которая через активацию MAPK3 / 4/6 приводит к фосфорилированию и активации p38. Фосфорилированный p38 отвечает за активацию апоптоза и остановку роста, таким образом, играя отрицательную роль в онкогенезе. В GCSC взаимодействие CD44v с xCT приводит к увеличению внутриклеточного GSH, что приводит к подавлению ROS-p38 MAPK и усилению развития опухоли. Затем специфическая терапия, направленная на путь CD44v-xCT, может нарушить способность GCSC защищаться от окислительного стресса, повышая чувствительность к доступным методам лечения рака. Действительно, ингибирование транспортера xCT сульфасалазином повышает чувствительность стволовых клеток рака желудка к химиопрепаратам, что положительно влияет на клиническую эффективность химиотерапии.

Сверхэкспрессия некоторых miRNA (oncomiR) из-за геномной амплификации их кодирующей области отрицательно регулирует уровни генов-супрессоров опухолей. Напротив, делеции или мутации потери функции в кодирующих областях miRNA, которые регулируют протоонкогены, приводят к снижению контроля над ростом и дифференцировкой клеток, раскрывая их канцерогенный потенциал. Так, HK-2, первый фермент, ограничивающий скорость гликолиза, может модулироваться miR-181b, которая имеет сайт связывания в 3'-нетранслируемой области транскрипта HK-2 и подавляется в тканях рака желудка.

Также выявлено подавление уровня экспрессии miR-422a, которое обратно коррелирует с размером опухоли и глубиной инфильтрации. miR-422a связана с метаболизмом, поскольку она подавляет активность PDK2, восстанавливая превращение пирувата в Acetyl-CoA через фермент PDH. Также в GC были обнаружены неканонические miRNA, которые независимы от Drosha, фермента, ответственного за процессинг miRNA. В частности, было обнаружено, что miR-6778-5p поддерживает стволовые свойства GCSC путем блокирова -ния оси YWHAE / c-MYC, ответственной за сниженную экспрессию SHMT1, цитозольного изофермента, участвующего в метаболизме одноуглеродного фолат пути.

В GC lnc-MSCC1-AS1 способствует устойчивости к химиотерапии за счет перепрограммирования метаболизма липидов. Эту роль приписывают антагонизму с miR-145-5p, которая способствует апоптозу опухолевых клеток за счет увеличения уровней ROS и токсичности, связанной с лекарством.

Опухолевые клетки обладают способностью ретродифференцироваться в незрелые состояния под влиянием своего микроокружения. Важно отметить, что это фенотипическое преобразование происходит параллельно с метаболической перестройкой, и согласно теории метаболизма, метаболическое перепрограммирование представляет собой первый шаг эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) и приобретения черт стволовости. Помимо провоспалительных цитокинов, которые, как известно, инициируют процесс ретродифференцировки, высвобождение катехоламинов в микроокружении опухоли может модулировать как ЕМТ, так и метаболические изменения в раковых клетках за счет активации факторов транскрипции ЕМТ (ZEB1, Snail или Slug (SNAI2)).

В отличие от нормальных клеток, опухолевые клетки обычно подвергаются неполной ЭМП, которая наделяет клетки способностью избегать апоптоза, аноикиса и старения и избегать иммунного надзора (см. выше). Они могут переходить из состояния покоя в состояние пролиферации и / или совершать дифференцировку, при этом производные дифференцированные клетки способны ретродифференцироваться к состоянию CSC. Так, воспалительная среда, содержащая трансформирующий фактор роста TGF-β1, интерлейкин IL-6 и фактор некроза опухоли TNF-α, запускает EMT и направляет дифференцированные опухолевые гепатоциты в программу ретродифференцировки по отношению к клеткам, несущим CSC фенотип. Также при раке груди IL-6, секретируемый опухолевыми клетками, участвует в инициации EMT, что приводит к обогащению субпопуляции CSC-подобных CD44 + клеток с мезенхимальным фенотипом и инвазивными свойствами.

Перепрограммирование от гликолиза к окислительному фосфорилированию (OXPHOS) происходит во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, в то время как обратный сдвиг от OXHPOS к гликолизу происходит во время генетического репрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. (ИПС). Принятие гликолитического метаболизма может быть вызвано ограничениями микросреды, такими как гипоксическая среда, или вызвано дисфункцией митохондрий. К сожалению, высокая пластичность опухолевых клеток позволяет им перемещаться по осям метаболизма / дифференцировки, чтобы адаптироваться к окружающей среде. Это свойство способствует устойчивости к химиотерапии и рецидиву рака.

Продолжим.

В основе регуляции стволовых клеток кишечника лежит постоянное перекрестное взаимодействие между эпителиальными и лежащими в основе мезенхимальными клетками в нише стволовых клеток кишечника. Эти перекрестные связи опосредуются ключевыми путями, включая пути Wnt, Hedgehog (HH), Notch, PI3K и BMP. Нарушения в этом тонко регулируемом взаимодействии могут как инициировать опухоли кишечника, так и в сочетании с дополнительными генетическими изменениями или эпигенической активацией эмбриональных процессов, таких как эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), приводить к инвазии и метастазированию опухоли.

Так как передача сигналов Wnt является важным детерминантом стволовости кишечника, был идентифицирован ген-мишень для Wnt, Lgr5 / GPR49, который экспрессируется исключительно в столбчатых клетках основания крипт (CBCs). CBCs расположены между клетками Панета, а позже были предложены как ISCs. Они также экспрессируют Msi-1, который важен для передачи сигналов Notch путем ингибирования экспрессии репрессора Notch Numb.
Lgr5 / GPR49 может также экспрессироваться в компартменте стволовых клеток других эпителиальных тканей, включая волосяной фолликул, молочную железу, эпителий желудка и, что важно, также в базальных областях крипт толстой кишки.

Связывание лигандов Wnt с их рецепторами, Fzd / LRP5 / 6, предотвращает деградацию основного эффекторного β-катенина комплексом деструкции, содержащим APC и Axin1 / 2. Β-Catenin перемещается в ядро, где он действует как активатор транскрипции после связывания с членами семейства TCF / LEF (см. выше). Недостаток TCF4 приводит к истощению компартмента эпителиальных стволовых клеток в тонкой и толстой кишке. Другие мишени Wnt включают c-myc и cyclin D1, которые вместе с передачей сигналов Notch регулируют переключение ISC на транзитные амплификации клеток-предшественников секреторного эпителия крипт. Также наблюдается повышенная экспрессия гена-мишени Wnt сурвивина, который также считается предполагаемым маркером стволовых клеток. Впрочем, дифференциальная экспрессия генов-мишеней Wnt указывает на то, что эффекты передачи сигналов Wnt координируются посредством взаимодействия с другими сигнальными путями.

Почти все колоректальные аденомы и карциномы человека обнаруживают генетические изменения в одном из компонентов пути Wnt, в основном APC с потерей функции или мутации, активирующие β-catenin (см. выше). Мутации APC приводят к переходу от асимметричного к симметричному делению ISCs.

Сорок процентов всех колоректальных карцином человека показывают активированный путь PI3K-Akt, в основном из-за инактивации PTEN. Более того, наследственные мутации PTEN (синдром Каудена) приводят к возникновению гамартоматозных полипов кишечника. Передача сигналов PI3K усиливает самообновление ISC, что может быть объяснено связью между передачей сигналов PI3K и путем Wnt: p-Akt может фосфорилировать β-catenin, главный эффектор канонического пути Wnt. PTEN экспрессируется в градиенте между криптой и просветом с наиболее сильной экспрессией в клетках просвета эпителия и, таким образом, может участвовать в ограничении передачи сигналов Wnt к основанию крипты.

Костные морфогенетические белки (BMP) связываются с рецепторами BMP I или II типа (BMPR1 или BMPR2). Это приводит к фосфорилированию SMAD1, 5 или 8, которые затем образуют гетеродимер с SMAD4, перемещаются в ядро ​​и действуют как активаторы транскрипции. В кишечнике BMP4 секретируется межворсинчатыми стромальными клетками, а BMPR1 экспрессируется во всех эпителиальных клетках кишечника, способствуя их дифференциации. Так, ювенильный полипоз человека связан с мутациями в генах SMAD4 / DPC4 или BMPR1A. Физиологическими ингибиторами пути BMP являются Noggin и Gremlin, которые связывают и инактивируют BMP; эти антагонисты BMP экспрессируются в субэпителиальных миофибробластах кишечника в основании крипт.

Ингибирование передачи сигналов BMP в эпителиальных клетках кишечника с помощью Gremlin активирует передачу сигналов Wnt. Более того, BMP стабилизирует PTEN, тем самым приводя к снижению активности Akt и последующему снижению накопления ядерного β-катенина.

Передача сигналов Notch контролирует решения клеточной судьбы в развитии многих тканей. Лиганды Delta или Jagged связываются с рецептором Notch, тем самым вызывая его протеолитическое расщепление γ-секретазой. Фрагмент расщепления Notch, NCID, перемещается в ядро, где он действует как фактор транскрипции после димеризации с помощью RBP-jκ / CSL. Это индуцирует экспрессию фактора транскрипции bHLH, воздействующего на энхансер Hes, который в конечном итоге активирует факторы, участвующие в контроле пролиферации и дифференцировки. Нокаут RBP-jκ или Hes1 приводит к увеличению количества секреторных эпителиальных клеток, а регулируемое снижение передачи сигналов Notch в сотрудничестве с активацией специфических факторов bHLH, таких как Atoh1 и NeuroD, индуцирует специфическую дифференцировку в кишечные эпителиальные клоны.

Морфогены Sonic hedgehog (Shh) и Indian hedgehog (Ihh) секретируются эпителиальными клетками, а их рецептор Patched (PTCH) экспрессируется в субэпителиальных миофибробластах. Следовательно, передача сигналов Hedgehog (HH) не участвует напрямую в судьбе эпителиальных клеток, но важна для построения правильной общей структуры крипт и ворсинок слизистой оболочки кишечника. Поэтому нарушение передачи сигналов HH также оказывает сильные вторичные эффекты на эпителиальные клетки кишечника. При этом передача сигналов Wnt усиливается, увеличивается пролиферация и в ворсинах образуются атипичные структуры крипт. Эти эффекты могут быть приписаны снижению экспрессии BMP стромальными клетками, которая обычно запускается HH. Более того, Ihh, подавляет экспрессию TCF4 и β-catenin и, таким образом, его паттерн экспрессии с макси -мумом на сайте просвета крипт в эпителии толстой кишки ограничивает передачу сигналов Wnt к основанию крипт.

Упрощенный взгляд на нишу стволовых клеток, который может оказаться гораздо более сложным: предполагаемые перекрестные связи передачи сигналов, определяющие нишу стволовых клеток и нишу дифференцирующихся клеток. В верхних областях крипт Ihh запускает экспрессию BMP в стромальных клетках, что затем активирует экспрессию PTEN в эпителиальных клетках. Все три фактора прямо или косвенно ингибируют передачу сигналов Wnt.
В самой нише стволовых клеток окружающие стромальные клетки секретируют ингибиторы BMP Noggin и Gremlin, что приводит к ослаблению репрессии передачи сигналов Wnt. Кроме того, строма обеспечивает лиганды Wnt для индукции передачи сигналов Wnt через рецепторы Fzd в стволовых клетках и транзитно-амплифицирующих клетках.

На продвинутой стадии аденомы эпителий обнаруживает большие области незрелого фенотипа, напоминающий ограниченную зону транзита-амплификации в нижних частях нормальных крипт и указывающий на рост популяции пролиферативных клеток. Более того, ядерный β-catenin все чаще обнаруживается на всем протяжении крипт и ассоциируется в аденомах человека с повышенной дисплазией .

Рак можно рассматривать, по крайней мере частично, как следствие нерегулируемого контроля стволовых клеток. Обоснование, подтверждающее происхождение опухолей кишечника стволовыми клетками:
1. В отличие от короткоживущих дифференцированных кишечных эпителиальных клеток, в этой высокооборотной ткани ISC являются долгоживущими, что позволяет накапливать критические генетические изменения.
2. При колоректальном раке наиболее частые, ограничивающие скорость мутации, такие как мутации, встречающиеся в гене APC, усиливают передачу сигналов Wnt, которая оказывается решающим регулятором ISC.
3. Типичные колоректальные аденокарциномы человека и соответствующие метастазы неоднородны и демонстрируют множество стадий дифференцировки в пределах отдельной опухоли, что соответствует происхождению стволовых клеток.
4. Концепция раковых стволовых клеток, первоначально разработанная для гематопоэтических неоплазий, становится общепринятой для солидных видов рака, включая колоректальный рак.

Продолжим.

Предполагается, что дифференцированная активация передачи сигналов Wnt регулирует разные функции дозозависимым образом. Так, инициирующие мутации (APC или β-catenin) приводят к слабой активации передачи сигналов Wnt, достаточной для нарушения нормальной регуляции ISC. Дополнительные соматические мутации, например, как показано для KRAS, или триггеры окружающей среды характорны для наиболее распространенных колоректальных аденокарцином человека. При этом динамическое микроокружение опухоли с гипоксией и воспалением может быть ответственным за варианты опухолевых клеток через геномную нестабильность и через эпигенетические изменения, что делает опухоль непредсказуемо разнообразной и трудно поддающейся лечению.

Также в эпителиальных клетках молочной железы человека активаторы EMT, например FoxC2, также могут придавать свойства стволовых клеток эпителиальным клеткам. А Lgr5 необходим для поддержания стволовых клеток рака груди и выявлена положительная корреляция между высокой экспрессией Lgr5 и более короткой выживаемостью пациентов.

Маркеры рака желудочно-кишечного тракта :
Колоректальный CD133 CD44, EpCAM, CD166
Гепатоцеллюлярный CD133 CD133
Поджелудочной железы, CXCR4 CD24, CD44, CD326 / ESA
играют важную роль в определении ISC и контроле кишечного морфогенеза и дифференцировки. Lgr5 также известный как рецептор, связанный с G-белком 49 (GPR49), является «сиротским» рецептором, принадлежащим к семейству G-белковых рецепторов (GPCR). Lgr5 модулирует силу канонической передачи сигналов Wnt посредством связывания со своим лигандом R-spondin. Нацеливание на клетки Lgr5 + антител, конъюгированных с различными лекарствами, демонстрирует высокую эффективность в уменьшении размера опухоли и пролиферации клеток рака толстой кишки. Впрочем, повторное появление Lgr5 + клеток после полного устранения Lgr5 + колоректального рака может быть результатом пластичности Lgr5- колоректального рака и перехода между Lgr5 + CSCs и Lgr5- CSCs.

Хронические воспалительные заболевания являются общепризнанными причинами рака; так, ось интерлейкин-33 (IL-33) / регуляторных Т-клеток (Tregs) может стать потенциальной терапевтической мишенью для лечения злокачественных опухолей, связанных с воспалением. Одним из ключевых медиаторов, обеспечивающих трансформацию ISC, является антиапоптотический белок BCL-2, который одновременно высоко экспрессируется в Lgr5 + CBC и является геном-мишенью пути Nf-κB. Более того, учитывая способность кишечных эпителиальных клеток к пластичности во время повреждения и регенерации тканей, кажется вероятным, что воспалительные сигналы из окружающей среды создают дифференцированные клетки с таким же онкогенным потенциалом, как и клетки ISC.

Нейтрофилы, рекрутируемые во время воспаления легких, могут инициировать пробуждение спящих раковых клеток.

Обычно считается, что активация воспалительного пути ядерного фактора NF -κB приводит к про-онкогенному воспалительному микроокружению. А комплекс IκB-киназы (IKKα и IKKβ) и его регуляторная субъединица (IKKγ) регулируют передачу сигналов NF-κB, при этом ядерная IκB-киназа α (IKKα) может напрямую связываться с промоторами факторов воспаления и Lgr5, что, в свою очередь, усиливает экспрессию Lgr5, в том числе за счет активации сигнального пути STAT3 во время прогрессирования, например, базальноклеточной карциномы. Впрочем сообщалось о RSPO2-индуцированной, Lgr5-зависимой передаче сигналов Wnt с отрицательной обратной связью, проявляющей в колоректальных опухолях супрессивную активность .

Морфологическая структура ткани кишечника предотвращает быстрое распространение мутировавших клеток, поскольку каждая из этих крипт сама по себе является динамической клеточной нишей без какого-либо обмена клетками между криптами. Однако количество крипт нестабильно из-за двух процессов, называемых делением и синтезом, что означает раздвоение и столкновение крипт соответственно. Эти противодействующие процессы компенсируют друг друга и случаются нечасто, если не происходит повреждение тканей.

В криптах с мутацией Kras наблюдается гораздо более высокая скорость деления. Множественные KRAS мутированные соседние крипты могут окружать CRC, предполагая , что в пределах области от KRAS мутантных крипт одна крипта подверглась дальнейшей трансформации. Таким образом, деление крипт, по-видимому, является важным механизмом злокачественной трансформации и прогрессирования в кишечнике, включая процесс, называемый полевой канцеризацией. Она представляет собой замену популяции нормальных клеток популяцией клеток, примированных к раку, которая может не демонстрировать морфологических изменений.

Как только аденома образуется при разрастании мутировавших крипт и имеет размер не менее 1 см, существует ~ 25% риск того, что эта новообразованная аденома подвергнется в следующие два десятилетия злокачественной трансформации в инвазивную карциному. В аденоматозных криптах присутствует ~ 9 функциональных опухолевых стволовых клеток на сотни клеток в каждой железе. Это контрастирует с процентом клеток Lgr5 +, который обнаруживается в аденомах, примерно ~ 20% от общей популяции (~ 400 клеток на железу), то есть только часть стволовых клеток аденомы являются ОСК.
В случае аденом человека была также продемонстрирована множественная дифференцировка в пределах железистых структур, что предполагает существование мультипотентных стволовых клеток. Уже на ранней стадии туморогенеза также возникает интрааденомное эпигенетическое клональное разнообразие.

Во время роста CRC продемонстрирована явная гетерогенность в динамике роста пула раковых клеток в различных областях опухоли, например, в клетках, расположенных рядом с границей или ближе к центру. Примечательно, что клоногенный рост происходит в основном на границе опухоли, а не в центре опухоли, то есть размножаются в основном окислительные опухолевые клетки, как я уже упоминал, предпочтительно использующие лактат для получения энергии.

Вставка.

Подавляющее большинство эпителиальных опухолей (раков) различной органной локализации (легкие, предстательная железа, молочная железа) ограничиваются поражениями in situ, которые могут оставаться недиагностированными в течение жизни человека. Это соответствует моей концепции двухэтапного канцерогенеза (см. выше). Большинство генетических изменений, обнаруживаемых в инвазивных и метастатических опухолях, уже присутствуют в фенотипически еще неизмененных клетках, а также клетках с фенотипом предопухолевых изменений (очаговая гиперплазия, мета- и дисплазия) задолго до развития рака. Ткань с накопленными генетическими и эпигенетическими изменениями определяют как поле канцеризации, или опухолевое поле.

Многоступенчатая геномная модель канцерогенеза начинается с приобретения клеткой одной или нескольких геномных или эпигеномных аберраций, обеспечивающих ее пролиферативное превосходство. Затем формируется клональное поле подобных клеток, еще сохраняющих нормальный фенотип и не нарушающих гистоархитектоники ткани.
Трансформация нормальных клеток в опухолевые посредством этих механизмов не обязательно означает развитие рака, так как пролиферация опухолевой клетки может быть прервана апоптозом (если его механизмы не повреждены) и тесно связана с работой гена р53. С накоплением генетических изменений, способствующих увеличению пролиферативного потенциала, и нарастанием фенотипических различий между клональными популяциями одна или несколько клеток приобретают признаки злокачественной трансформации – способность к эпителиально-мезенхимальному переходу, инвазии и метастазированию.

Модель предполагает, что клетки, претерпевшие ранние, но не все необходимые для опухолевой трансформации генетические изменения, и составляют поле канцеризации. Примером опухолевого поля являются предопухолевые заболевания, характеризующиеся повышенным риском развития рака, в частности пищевод Барретта (см. выше).

Среди важнейших детерминант формирования опухолевого поля выделяют старение, действие химических, физических мутагенов и хронического воспаления, а среди механизмов формирования поля большое значение имеют метилирование ДНК и дисрегуляция микроРНК. Изменения в стромальном компартменте ткани (экстрацеллюлярном матриксе, клетках соединительной ткани) могут играть ведущую роль в инициации опухолевого процесса, что определяется появлением особого опухоль-ассоциированного фенотипа фибробластов и макрофагов, а также изменением иммунного статуса ткани.

По мнению одних авторов, поле канцеризации ассоциируется с генетическими и эпигенетическими повреждениями эпителия, граничащего с зоной опухолевого роста, в представлении других оно связано с меняющимся характером экспрессии различных сигнальных молекул (протеаз и их ингибиторов, воспалительных медиаторов и хемокинов), зависящим, в свою очередь, от присутствующей линии фибробластов, макрофагов и накапливаемых в ткани Tregs-лимфоцитов, а также от особенностей локального метаболического (в частности при ожирении и сахарном диабете) и гормонального статуса ткани.

В полях канцеризации регистрируются множественные генетические, эпигенетические и хромосомные изменения, происходящие в гистологически неизмененном эпителии. Повышенное метилирование ДНК в промоторной области генов-онкосупрессоров аналогично механизму делеции хромосомных фрагментов и может способствовать последующему развитию опухоли. Эпигенетически могут быть подавлены и гены, участвующие в репарации повреждений ДНК. Признаком полевой канцеризации являются также мутации митохондриальной ДНК, которые обнаруживаются не только в соседствующем с опухолью эпителии, но еще чаще – в клетках стромы. Так как эпигенетическое подавление генов и митохондриальная дисфункция являются признаками старения, они, вероятно, документируют важную связь между возрастным увеличением риска развития рака и событиями полевой канцеризации. Обнаружено и повышенное метилирование микроРНК с предполагаемой онкосупрессивной функцией, в частности в полях рака желудка.

Гистологически в качестве первых признаков формирования опухолевого поля рассматриваются очаги дисплазии и неоангиогенеза, при этом поле может распространяться на весь орган или составлять его часть. Так, установлено, что в подверженных воздействию солнца, но гистологически неизмененных участках кожи (особенно у стареющих людей) в эпидермисе содержится значительное количество клеток с проонкогенными мутациями р53. Эти клетки определяются в виде кластеров, которые могут увеличиваться в размерах с течением времени. Клеточные популяции с мутациями р53 в гистологически неизмененных тканях также были обнаружены при раке других органных локализаций: в эпителии полости рта, слизистой оболочке бронхов, мочевого пузыря и пищевода.

В качестве важнейших проявлений полевой канцеризации рассматриваются высокая частота мультифокальности рака (множественных поражений первичного происхождения одного и того же или различных гистологических типов), а также синхронные или метахронные опухоли, которые чаще остаются неучитываемыми и неоцениваемыми событиями. Существует большая сложность в установлении различий между действительно независимыми первичными поражениями и поражениями, являющимися результатом отдаленного распространения опухоли.

Как правило, при эпидемиологической оценке мультифокальные опухоли одной органной локализации считаются как один вид рака, а предраковые поражения обычно вообще исключаются из статистики рака, поэтому статистика первично-множественных поражений в действительности значительно занижена. Этот вывод подтверждается огромным числом (до 30–40 % случаев) выявления предраковых и злокачественных поражений при аутопсии в случаях смерти от других причин.

В настоящее время представления о канцерогенезе активно смещаются в направлении важнейшей роли в этом процессе стромы – экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), формирующего клеточную микросреду и активно регулирующего важнейшие процессы в жизни клетки (пролиферацию, адгезию, дифференцировку, миграцию, апоптоз), а также клеток соединительной ткани, обладающих широким спектром функциональной активности, в том числе определяющих характер ЭЦМ. Изменения в сигнальной и транскрипционной программах стромальных клеток могут предшествовать изменениям в эпителиальных клетках (или действовать независимо от них) и фактически выступать в качестве драйвера опухолевого процесса.

Понимание концепции опухолевого поля, а значит, предопухолевых изменений при раке различной органной локализации, имеет большое значение для раннего выявления этих изменений, профилактики развития рака, его ранней диагностики и разработки новой тактики таргетной терапии.

Продолжим.

Основные положения концепции опухолевого поля были также прослежены на примере плоскоклеточного рака кожи (ПКРК), характеризующегося высокой частотой очагов дисплазии и cancer in situ в перитуморозной зоне. В модели ПКРК концепция полевой канцеризации имеет два важных аспекта для управления канцерогенезом. Во-первых, ПКРК возникает из множественных очагов предраковых изменений, но наличие рака хотя бы одной области сопровождается повышенным риском возникновения рака в других областях. Во-вторых, клинический рецидив ПКРК после полного хирургического иссечения может представлять собой развитие нового первичного рака, и риск рецидива может коррелировать со степенью злокачественности поля. Установлено, что пациенты с ПКРК от двух до девяти анатомических областей имеют двукратно повышенный риск рецидива по сравнению с пациентами с раком одной области. Поражение раком десяти и более областей сопровождается 12-кратным увеличением риска местного рецидива.

Важнейшей движущей силой эпидермального канцерогенеза является ультрафиолетовое (УФ) излучение, которое прямо (при длине волны 290–320 нм) или косвенно (при длине волны излучения 320–400 нм) повреждает ДНК клеток эпидермиса, обусловливая соматические мутации: инактивирующие – в генах-онкосупрессорах и активирующие – в онкогенах. Установлено, что и рак, и актинический кератоз, относящеся к важнейшим предопухолевым изменениям кожи и представляющие собой очаги эпидермальной дисплазии, имеют сходные генетические мутации, среди которых чаще встречается утрата функции генов-онкосупрессоров – ТР53 и NOTCH1, которая определяется в 95 % случаев при ПКРК и в 75 % случаев актинического кератоза. При этом чем больше очагов aктинического кератоза в одной анатомической области, тем выше риск развития ПКРК. Вторым эффектом УФ-излучения, способствующим эпидермальному канцерогенезу, оказывается локальная (местная) иммуносупрессия.

Как уже установлено, показатель иммунного статуса влияет на формирование полей канцеризации при опухолях различной органной локализации. В частности, иммунокоррегирующая терапия приобретает большое значение в лечении очагов лейкоплакии, которая рассматривается как предопухолевое заболевание полости рта. Исследование экспрессии PD1 (мембранный белок надсемейства иммуноглобулинов, участвующий в дифференцировке иммунных клеток), CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов в очагах лейкоплакии, подвергшихся и не подвергшихся трансформации в ПКРПР, показало отсутствие различий в экспрессии PD1 и CD4+ и выявило значительное увеличение экспрессии CD8+ в очагах, которые фенотипически эволюционизировали в карциному.

Воспаление может оказывать как стимулирующее, так и подавляющее влияние на канцерогенез, что определяется фенотипической пластичностью макрофагов, выполняющих различные функции при остром и хроническом воспалении. Так, изменения при тесно связанном с хроническим воспалением актиническом кератозе могут быть эффективно устранены при лечении агонистами толл-подобных рецепторов (TLR), вызывающими мощную острую воспалительную реакцию, которая оказывает подавляющее действие на развитие рака. В очаге воспаления макрофаги могут дифференцироваться в так называемый «убивающий» фенотип М1, осуществляющий элиминацию микробов и раковых клеток, и «разрешающий» фенотип М2, направленный на разрешение или сдерживание острого токсического воспаления и связанный с «тлеющим» хроническим воспалением, которое способствует опухолевой трансформации.

Фенотипические особенности макрофагов напрямую определяются опухолевыми клетками и клеточным составом опухолевой микросреды посредством межклеточного обмена различными по составу экзосомами, в том числе содержащими микроРНК (miR). МикроРНК являются эндогенными, некодирующими однонитевыми РНК, которые ингибируют трансляцию и способствуют деградации мессенджерных РНК с комплементарными последовательностями.

Характер экспрессии микроРНК зависит от типов клеток и тканей и играет ключевую роль в регуляции различных биологических процессов на трансляционном и посттрансляционном уровнях. Так, при немелкоклеточном раке легкого miR-130a, miR-1207-5p и miR-125b определяют дифференцировку макрофагов в направлении М1 фенотипа, ассоциирующегося с экспрессией провоспалительных цитокинов: интерлейкина-12 (IL), IL-23, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и гамма-интерферона (IFN-γ), которые дополнительно увеличивают количество активных форм кислорода, что приводит к эффективному подавлению опухоли.

В подтип M2 макрофаги дифференцируются при воздействии противовоспалительных цитокинов: IL-4, IL-10, IL-13 или трансформирующего фактора роста бета (TGFβ). Активированные макрофаги M1 проявляют бактерицидную, иммуностимулирующую и подавляющую опухоль активность, в то время как макрофаги M2 участвуют в разрешении воспаления, процессах ремоделирования ткани и играют протуморогенную роль.

Опухолевая микросреда, характеризующаяся как гипоксическая, обусловливает активацию генов, ответственных за фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа (HIF-1), являющийся, в свою очередь, модулятором поляризации макрофагов в M2 фенотип.
На этот процесс влияет и активация одних микроРНК (miR-103a, miR-21-5p и miR-320a) и подавление других (miR-4319, miR-130a и miR-155). Опухольассоциированные макрофаги (CAM), имеющие фенотип M2 и экспрессирующие IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β, PGE2, в сочетании с высоким уровнем в опухолевой микросреде HIF-1α стимулируют ангиогенез, ремоделирование матрикса, способствуют подавлению иммунитета, развитию эпителиально-мезенхимального перехода, а значит, прогрессированию и метастазированию опухоли.

Исследования канцерогенеза в органах желудочно-кишечного тракта показывают, что воспаление может провоцировать развитие рака, и это подтверждается высокой частотой колит-ассоциированного рака. Сильная причинная связь существует также между инфекцией Helicobacter pylori (H. pylori) и раком желудка, при котором воспаление рассматривается в качестве основной причины. Прямым доказательством этого оказалась возможность инициации желудочного канцерогенеза при трансгенной сверхэкспрессии провоспалительного цитокина IL-1β в слизистой оболочке желудка (СОЖ), а также развитие рака через каскад NF-kB (ядерный фактор «каппа-би») – активирующих цитокинов и рекрутирование иммуномодулирующих клеток.

Повышенная экспрессия IL-1β приводила не только к увеличению пролиферации и трансформации желудочных эпителиоцитов, но и атрофическим изменениям в стромальном компартменте СОЖ (слизистой оболочке желудка). В свою очередь, атрофия стромы и связанное с ней старение фибробластов могут не только вносить значительный вклад в процесс полевой канцеризации, но и играть в нем определяющую роль.
Установлена связь между инфицированием H. pylori и эпигенетическим выключением экспрессии генов-онкосупрессоров посредством микроРНК в фенотипически неизмененной СОЖ. Так, экспрессия miR-21, miR-155 и miR-223 в СОЖ в сравнении с контролем постепенно нарастает в патологическом ряду от хронического гастрита (ХГ) к хроническому атрофическому гастриту (ХАГ) и раку желудка (РЖ). Экспрессия miR-10а, miR-21 и miR135b также постепенно нарастает от зоны неизмененной СОЖ к опухоли.

Интересно, что среди исследованных микроРНК не выявляется разницы в их экспрессии при РЖ кишечного и диффузного типов, которые, как известно, отличаются разными патогенетическими механизмами. Вместе с тем при диффузном РЖ установлена более низкая экспрессия miR-26а. В целом, глобальное снижение уровня активных микроРНК при РЖ и опухолях других локализаций позволяет рассматривать большую часть этих молекул как опухолевые супрессоры.

Часто за потоком теории теряется главное - суть. А суть такова: Клетки заставляют меняться споровые - токсоплазма, которая вызывает доброкачественные опухоли и кандида, вызывающая злокачественные. Все мои онкобольные сдавали анализ крови на антитела к этим патогенам и выбранное дальнейшее лечение было эффективно. Именно споровые создают симбиоз клеток гриба и человеческого организма. Посмотрите с этого угла на вашу теорию. Мое мнение подтверждено практикой.

Валентин, у меня также есть средства, которые давят ваши споровые с любого угла, но у Альберта более углубленные знания на эту проблему.

Продолжим углубленным изучением рака поджелудочной железы.

Всего насчитывают 5 гистологических форм РПЖ, но наиболее распространена аденокарцинома, наблюдающаяся в 80 % случаев рака поджелудочной железы. Чаще всего она исходит из эпителия выводных протоков. Вокруг опухоли желези*стые элементы подвергаются резкой атрофии, выводные прото*ки расширены, а окружающая их ткань склерозирована.

Выявлены три основных предшественника инвазивной аденокарциномы поджелу -дочной железы : интраэпителиальная неоплазия поджелудочной железы (PanIN), IPMN (Intraduktal Papillär Muzinöse Neoplasien) и муцинозно-кистозное новообразование (MCN). PanIN является наиболее распространенным типом предшественников опухоли, возникающих из эпителиальных клеток протоков. Предполагается, что эти поражения проходят путь прогрессирования от интраэпителиальной протоковой гиперплазии (PanIN-1) через умеренную дисплазию (PanIN-2) до дисплазии высокой степени (карцинома in situ) и инвазивной карциномы . По мере увеличения протоковой атипии увеличивается частота генетических изменений; в зрелой опухоли их в среднем около 60.
Хотя IPMN и MCN ответственны только за меньшую часть случаев рака поджелудочной железы (менее 15%), они дают возможность идентифицировать предраковые поражения поджелудочной железы, особенно с увеличением использования неинвазивных процедур визуализации брюшной полости высокого разрешения .
Особенностью РПЖ является выраженный склероз как самой ткани опухоли еще на стадии рак in situ, так и вокруг опухоли, образуя как бы защитный вал. Это обьясняется тем, что на стадии тканевого атипизма вновь образующиеся атипичные протоки (см. ниже) часто тупиковые и агрессивный поджелудочный сок не находя выхода начинает переваривать окружающую ткань железы.

В отличие от большинства опухолей, клетки РПЖ могут образовывать только небольшие островки в обширной строме опухоли. Основными клеточными компонентами являются ассоциированные с раком фибробласты (CAF), преимущественно происходящие из звездчатых клеток поджелудочной железы (PSC) и воспалительных клеток. В склерозированной ткани мало кровеносных сосудов, в результате чего опухолевые клетки находятся в состоянии постоянной гипоксии и выживают наиболее агрессивные субклоны. А изоляция опухолевых клеток задерживает клинические проявления.

Одной из основных проблем, стоящих перед этим заболеванием, является гетерогенность, наблюдаемая среди пациентов в отношении симптомов, клинической эволюции, предрасположенности к раннему метастазированию и чувствительности к лечению. Гетерогенность может возникать на разных этапах эволюции опухоли, начиная с первых генетических мутаций, которые привели к возникновению опухоли, ее взаимодействия с микроокружением и в результате давления отбора и клональной экспансии. Тем не менее, были охарактеризованы два клинических подтипа PDAC: базальный (сквамозный), с худшим прогнозом и классический. Базальный подтип частично - но не полностью - совпадает с типом плоских клеток и с EMT; он, как правило, более устойчив к различным химиотерапевтическим средствам и особенно к схеме лечения, называемой FOLFIRINOX (фолиевая кислота, 5-фторурацил (5-FU), иринотекан и оксалиплатин).
Эти фенотипы PDAC определяются различными эпигенетическими ландшафтами, в частности паттернами метилирования ДНК, которые трансдуцируются на уровне транскрипции и изменяют взаимодействие между опухолью и ее стромой. Так, ключевыми игроками в гетерогенности PDAC являются супер-энхансеры; комплекс SWI / SNF ремоделирования нуклеосом может регулировать эти супер-энхансеры, и, что интересно, генетические изменения у членов этого комплекса часты среди опухолей PDAC. Когда комплекс SWI / SNF не способен правильно собираться, он не может противостоять поликомбо-репрессивному комплексу, локализованному в промоторах и типичных энхансерах генов дифференцировки, и это нарушение равновесия способствует онкогенезу.

Поскольку природа подтипов PDAC не является генетической, можно было бы преобразовать оба подтипа просто путем инактивации MET в базальных или GATA6 в классических выборках, что в опухолях часто и происходит. В запущенных случаях между этими двумя крайними формами опухолевого фенотипа имеется континиум промежуточных состояний.

Согласно современной концепции развития ПАПЖ (протоковой аденокарциномы ПЖ), клетками-родоначальниками ее классического подтипа являются ацинарные клетки. Ключевым инициирующим событием является АПМ. Этот процесс активируется при остром панкреатите и непосредственно связан с регенерацией ПЖ. В норме это заканчивается редифференциацией «протоковых» клеток в ацинарные, однако при появлении дополнительных факторов могут развиться ПанИН-I, II, III и в конечном итоге инвазивная аденокарцинома.
С другой стороны, ацинарные клетки, по-видимому, более чувствительны к распространенным мутациям, вызывающим рак поджелудочной железы, в первую очередь гена KRAS, и имеют тенденцию эффективно развиваться до PanIN и PDAC, тогда как протоковые клетки более устойчивы к мутантному KRAS. Кроме того, было продемонстрировано, что ацинарные клетки могут подвергаться трансдифференцировке с образованием популяции клеток DCLK1 + с фенотипом панкреатобилиарных предшественников, которые затем способствуют инициации и прогрессированию PDAC. Вообще, в практике следует уделять больше внимания идентификации клеточных клонов, а также их ассоциацию с подтипами PDAC.

Согласно новой классификации ПАК ПЖ выделяются четыре главных молекулярных подтипа: сквамозный (квазимезенхимальный), панкреатический классический (из клеток-предшественников), иммуногенный и аберрантно-дифференцированный экзокрино-эндокриноподобный (АДЭЭ).

Сквамозный подтип запускается ЕМТ-программой и характеризуется высокой экспрессией мезенхимальных маркеров и наихудшим прогнозом. Гистологически он включает железисто-плоскоклеточный рак ПЖ. Сквамозные опухоли богаты мутациями генов семейства TP53, отражающими активацию TP63ΔN и его транскрипционную сеть. Ген TP63ΔN стимулирует дифференцировку клеток плоского эпителия в противовес железистой дифференцировке эпителия протоков ПЖ.
Гиперметилирование генов, ответственных за апоптоз (PDX1, GATA6 и HNF1B), способствует развитию дедифференцированного и мезенхимального характера этого подтипа. Множество других фенотипических характеристик патогномоничны для сквамозного подтипа ПАК ПЖ: частые мутации гена KDM6A, ответственного за перестройку хроматина, активация сигнального пути TGF-β, гена MYC и т.д. Клеточные линии сквамозного подтипа более чувствительны к воздействию гемцитабина.

Панкреатический классический (из клеток-предшественников) подтип характеризуется наиболее эпителиальным характером ПАК ПЖ с высоким уровнем экспрессии эпителиальных маркеров, особенно CDH1/E-cadherin. Данный подтип по молекулярному фенотипу подобен KRAS-зависимым клеточным линиям ПАК ПЖ. Также присуща высокая экспрессия генов, способствующих развитию ПЖ (FOXA2/3, PDX2, MNX1 и GATA6); например, PDX2 индуцирует начальную дифференцировку эпителия поджелудочной железы. В отличие от сквамозного, этот подтип происходит из клеточных линий, чувствительных к ингибитору EGFR – эрлотинибу. Любопытна взаимосвязь классического подтипа ПАК ПЖ с развитием “диабета молодых” (MODY).

В подтипе c аберрантной эндокринной-экзокринной дифференцировкой (ADEX) нарушена регуляция генов, играющих роль в ацинарной и эндокринной дифференцировке, которая носит в норме взаимно исключающий характер, также в процессах регенерации и при панкреатите. Часть этих генов связана с активацией KRAS. ПАК ПЖ подтипа ADEX гистологически связан с ацинарно-клеточным раком.
Иммуногенный подтип ПАК ПЖ отличается различными иммуно-ассоциированными транскрипционными программами. Эти программы связаны с сигнальными путями и рецепторами В- и Т-клеток, представлением антигена и приобретенной иммунной супрессией через ключевые моменты соответствующих путей – CTLA4 и PD1. Кроме того, иммуногенный подтип ПАК ПЖ демонстрирует существенное увеличение в инфильтрате В- и Т-клеток. Гистологически ПАК ПЖ этого подтипа проявляются в виде муцинозных некистозных (коллоидных) опухолей и ПАК ПЖ, происходящих из ВПМО.

ПАК ПЖ в целом не чувствительна к новым классам ингибиторов типа анти-i-PD1 иммуномодуляторов (пембролизумаб). Однако ПАК ПЖ иммуногенного подтипа могут быть чувствительными к препаратам этой группы либо сами по себе, либо в сочетании с другими химиотерапевтическими средствами.

В инфильтрирующей карциноме происходит субклональное развитие генома рака во время прогрессирования опухоли. Клинические последствия субклональной эволюции при раке поджелудочной железы: канцерогенез поджелудочной железы следует за накоплением мутаций как у драйвера (водителя), так и у пассажира, кульминацией которых является образование клетки-основателя, которая станет родительским клоном карциномы. Родительский клон, который инициирует инфильтрирующую карциному, будет продолжать подвергаться клональной эволюции, приводя к образованию субклонов, которые отличаются наличием вновь приобретенных мутаций в гипотетических генах α, β, γ и Δ. Если терапия, нацеленная на субклон с мутантом β, эффективно очистит все раковые клетки, содержащие эту мутацию, со временем оставшиеся субклоны продолжат расти и появятся новые субклоны (например, ε).

Молекулярные изменения, которые накапливаются во время канцерогенеза поджелудочной железы, можно классифицировать на ранние (укорочение теломер и активирующие мутации в KRas в PanIN-1), промежуточные (инактивирующие мутации или эпигенетическое молчание CDKN2A в PanIN-2) и поздние (инактивирующие мутации р53 и SMAD4 в PanIN-3) события. Во время формирования PanIN могут также происходить мутации в других генах, впрочем наиболее значимо накопление мутаций, а не появление их в определенном порядке.
Наиболее распространенной является мутация в онкогене K-ras (встречается в 90% случаев). Приобретение онкогенной мутации KRas в ацинарных клетках поджелудочной железы приводит к их трансдифференцировке в протоковидные клетки. Онкогенные KRas могут также модулировать митохондриальный метаболизм и выработку АФК посредством регуляции рецептора трансферрина (TfR1), который высоко экспрессируется в ракe поджелудочной железы. Кроме того, КRas могут вызвать подавление дыхательной цепи комплекса I и III, приводя к митохондриальной дисфункции (что-то напоминает).

Ген Р16/CDKN2A при РПЖ инактивируется наиболее часто (в 95% наблюдений). Белок р16 играет критическую роль: его инактивация приводит к утрате контроля над клеточным циклом, так как продукт гена p16 INK4а ингибирует взаимодействие циклина D с циклин -зависимой киназой 4 (CDK4). В спорадических опухолях p16 иногда инактивируется гомозиготными делециями и внутригенными мутациями, а в остальном ген INK4a выключается путем метилирования промотора.

Ген-супрессор опухолей DPC4 расположен на хромосоме 18q21 и кодирует ядерный фактор транскрипции Smad 4 - важный элемент TGF-ß сигнального пути. При раке поджелудочной железы DPC4 был инактивирован в 55% наблюдений, а при других злокачественных опухолях инактивация этого гена происходит очень редко.
Канонический каскад передачи сигналов Smad инициируется фосфорилированием рецептор-регулируемых факторов транскрипции Smad (R-Smads) Smad2 и/или Smad3 активированным ALK5 (Anaplastic Lymphoma Kinase). Это позволяет связывать R-Smad с Smad4 и транслокацию комплекса в ядро, где он может привлекать транскрипционные коактиваторы или корепрессоры к Smad-связывающим элементам (SBE) в промоторах генов-мишеней TGF-β. Отметим, что потеря функции SMAD4 почти всегда происходила в связи с генетической инактивацией TP53 , но не наоборот, указывая на то, что изменения SMAD4 были связаны с генетическими изменениями TP53 .
Эта взаимосвязь также предполагает, что инактивация SMAD4 происходит позже, чем инактивация TP53. Трансформирующий фактор роста (TGF -β) действует как супрессор опухоли во время инициации рака, но как промотор опухоли во время прогрессирования опухоли. Рост опухолевых клеток TGF-β способен ингибировать путем тормозного взаимодействия с циклином D1.

При инвазивной карциноме гиперактивирован сигнальный путь Hedgehog; эта активация может быть зависимой от лиганда Hedgehog (при РПЖ) или из-за мутации Patched (при базально-клеточном раке кожи). Ингибирование этого пути препаратом циклопамином останавливает рост опухоли в эксперименте.

Ген р53. При раке поджелудочной железы инактивация этого гена-супрессора опухолей определяется в 50-70% наблюдений. р53 — это ядерный ДНК-связывающий белок, который влияет на старение клетки и контролирует клеточный цикл, запускает процесс клеточной гибели (апоптоз). Мутации в гене TP53 отменяют его функцию, приводя к генетической нестабильности и прогрессированию опухоли. р53 ингибирует клеточный цикл путем прямой инактивации CDK4 и косвенной инактивации p21, то есть функционирует на переходе G1 / S, блокируя вход в S-фазу, вызванный повреждением ДНК. Функции p53 также поддерживают геномную стабильность.
Потеря p53 связана с анеуплоидией, выдающейся особенностью карциномы поджелудочной железы; вообще на сегодняшний день большинство генов, которые считаются супрессорами метастазирования, демонстрируют признаки гаплоиндуцированности. Инактивация TP53 при SMAD4 дикого типа сильно обогащена нулевыми мутациями (нонсенс, делеция или сдвиг рамки), а при сопутствующей потере SMAD4 - миссенс-мутациями. При этом потеря SMAD4 частично устраняет остаточные цитостатические или апоптотические функции миссенс-мутантных белков TP53.

Специфические ингибиторы COX2 (СОХ — группа ферментов, участвующие в синтезе простаноидов, таких как простагландины, простациклины и тромбоксаны) могут предотвращать канцерогенез и вызывать апоптоз опухолевых клеток. Также путь липооксигеназы (LOX) превращает арахидоновую кислоту в мощные сигнальные медиаторы, такие как лейкотриен B4 (LTB4), способствующий развитию и прогрессированию рака человека. Сверхэкспрессия рецепторов LOX и LTB4 при раке поджелудочной железы человека образует аутокринную петлю, которая стимулирует пролиферацию клеток.

Активированные гены подтипа предшественников поджелудочной железы в основном участвуют в развитии поджелудочной железы (например, GATA6, BMP2, PDX1 и SHH) и передаче сигналов Ras (например, KITLG и RASA3). Плоскоклеточный (сквамозный) подтип демонстрирует обогащение путей с сильным онкогенным потенциалом (например, PI3K-AKT, Hippo и WNT), способствующим EMT (например, передача сигналов TGFβ) и дерегулирование генов, участвующих в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток (например, YAP1, CD44 , MYC и E2F7). Отметим, что устранение Kras приводит к переключению в сторону плоскоклеточного подтипа.

Впрочем подтипы опухолей лучше определяются специфическими эпигенетическими, транскрипционными и стромальными ландшафтами, чем генными мутациями (см. выше). А если эпигеном является основным фактором, ответственным за фенотипы PDAC, главное заключается в том, что это обратимое явление, а генетические мутации - нет.
Некоторые из эпигенетических регуляторов, обнаруженных в PDAC, являются H3K4-метилтрансферазой MLL2 и SETD3 и H3K-ацетилтрансферазой KAT2A, которые активируют транскрипцию. Другим регулятором, сверхэкспрессированным во всех образцах PDAC, является энхансер Zeste Homolog 2 (EZH2). Этот фермент является функциональным компонентом субъединицы 2-го репрессивного комплекса ремоделяции хроматина (PRC2) и катализирует триметилирование H3K27, в результате чего хроматин плотнее окутывает ДНК и мешает транскрипции.
Поликомб-репрессированные комплексы подавляют гены-супрессоры опухолей и гены пути Hedgehog (см. выше). Первый в своем классе пероральный селективный ингибитор EZH2, таземетостат показал благоприятные результаты у пациентов с рефрактерной В-клеточной неходжкинской лимфомой и запущенными солидными опухолями. NUPR1 является белком, который сверхэкспрессируется во время острого панкреатита, и участвует в ремоделировании хроматина посредством его взаимодействия с белками группы поликомб. Спиральные пептиды, предназначенные для нацеливания на NUPR1, оказывают кратковременный лечебный эффект.

Метилирование ДНК таким образом является эпигенетической меткой, которая вызывает молчание генов, удерживая ДНК в транскрипционно спокойном состоянии. Зебуларин, известный ингибитор метилирования ДНК, подталкивает стволовые клетки PDAC к более пролиферативному фенотипу с повышенной чувствительностью к современным химиотерапиям. Существует также подгруппа опухолей PDAC, которые были чувствительны к хорошо изученному децитабину.

Гистондеацетилаза 1 (HDAC1) является еще одним эпигенетическим модификатором, который сверхэкспрессируется в PDAC и может нарушать регуляцию паттерна ацетилирования гистона, что в целом активирует транскрипцию. В частности, более высокие уровни экспрессии HDAC 1, 7 или 8 связаны с худшей общей выживаемостью. Ингибирование HDAC может привести к активации генов-супрессоров опухоли.

Некодирующие РНК (нкРНК) транскрипты играют роль эпигенетических модификаторов, взаимодействуя с гистоновыми модифицирующими комплексами или с DNMT (DNA methyltransferase). Среди нкРНК лучше всего изучены микроРНК (миРНК), которые действуют как посттранскрипционные репрессоры, а в предраковых поражениях PDAC подавление miR-148, наряду с miR-217 и miR-375, является мета-сигнатурой PDAC. Различные стратегии доставки могут быть выполнены для восстановления уровней экспрессии miRNA. Одним из них является использование «нановекторов», которые состоят из липидных наночастиц. Они были успешно использованы для доставки miR-34a из транскрипционной сети p53 и кластера miR-143/145, который подавляет экспрессию KRAS2 в раковыклетках.

В целом, развитие эпигенетических лечебных препаратов сталкивается с несколькими проблемами, одной из наиболее важных из которых является отсутствие специфичности: все эпигенетические методы лечения влияют на общий геном. Кроме того, следует учитывать гетерогенность, поскольку маловероятно, что одно эпигенетическое лекарственное средство, отдельно или в сочетании с современными методами лечения, будет эффективным для всех опухолей.

Вставка.

Поджелудочная железа состоит из трех основных типов клеток: эндокринных клеток, ацинарных клеток и протоковых клеток. Их развитие строго контролируется регуляторной сетью факторов транскрипции, которые модулируют экспрессию генов. В эту сеть включены факторы транскрипции гомеобокса (PDX1, Pbx1, HB9), факторы транскрипции гомеопротеинов парного бокса (Pax4, Pax6), факторы транскрипции Forkhead Вох (Foxa1, Foxa2) и факторы транскрипции основной спирали-петли-спирали (bHLH) (ptf1a / p48, Mist1, нейрогенин3, NeuroD).

Самыми ранними генами, избирательно экспрессируемыми в препанкреатической энтодерме, являются два фактора транскрипции, фактор гомеодомена парахокс PDX1 и PTF1A. Ptf1a предпочтительно собирается в тримерный комплекс транскрипции PTF1 с белком E и Rbpj (или Rbpjl). Регулятор транскрипции RBPJ, иначе известный как CSL, представляет собой высококонсервативный ДНК-связывающий белок, который обеспечивает каноническую передачу сигналов Notch, являясь частью его транскрипционного комплекса. В развитии поджелудочной железы Ptf1a незаменим для контроля роста мультипотентных клеток-предшественников, а также для спецификации и поддержания ацинарных клеток.

Факторы транскрипции bHLH особенно важны для событий развития и дифференцировки из-за комбинаторной природы этих белков. Факторы bHLH подразделяются на две основные группы - белки класса A, которые включают широко экспрессируемые белки E12 / E47 / HEB, и белки класса B, которые демонстрируют ограниченный тканью паттерн экспрессии.
В большинстве случаев предпочтительный комплекс bHLH представляет собой гетеродимер, состоящий из члена класса A и члена класса B. Эти гетеродимеры связываются с сайтами E-box, обнаруженными в промоторных и энхансерных областях генов-мишеней, чтобы регулировать их транскрипцию. Было показано, что четыре белка bHLH класса B демонстрируют паттерн экспрессии, ограниченный поджелудочной железой (Neurogenin3, NeuroD, ptf1a / p48, Mist1).
Ген Neurogenin3 является нижестоящей мишенью передачи сигналов Notch и необходим для развития всех клонов эндокринных клеток поджелудочной железы. NeuroD, нижестоящий ген-мишень Neurogenin3, служит ключевым регулятором транскрипции гена инсулина в β-клетках.

Как только идентичность поджелудочной железы установлена, морфогенез ветвления в MPCs ведет к разделению на клетки кончиков (верхушки) и ствола, которые являются предшественниками ацинарных и протоковых структур, соответственно. В концевых клетках Ptf1α индуцирует Nr5a2, который сам напрямую регулирует Ptf1a в петле обратной связи, а также Gata4 и Rbpjl, тогда как клетки ствола определяются активностями генов Hnf1b, Sox9, Hnf6 и Hes1. Кроме того, расширение и поддержание экзокринного компартмента дополнительно поддерживается ингибированием пути Hippo для репрессии специфичных для эндокринной системы генов TF, включая Pax6, Ngn3, Isl1 и Nkx6-1. Активные сигналы Hippo также способствуют эндокринной судьбе, противодействуя активности Yap .

В дополнение к будущим судьбам ацинарных и протоковых клеток, эндокринный компартмент появляется в отдельных клетках внутри ствола, которые активируют Ngn3, предположительно за счет латерального ингибирования, организованного путем Notch. Временные волны экспрессии TF инициируют их созревание, чтобы гарантировать однонаправленную спецификацию уникальных типов клеток, включая Neurod1, Insm1 и Rfx6, потеря которых ставит под угрозу идентичность и функцию клеток островков.

Идентичность ацинарных клеток поддерживается несколькими взаимодействующими ТФ, такими как Ptf1α (см. выше) и Mist1. Подавление этих TF приводит к приобретению характеристик клеток-предшественников и усилению образования ADM и PanIN, что подчеркивает важность поддержания экспрессии этих факторов идентичности для предотвращения инициации опухоли.

MIST1 представляет собой пионерский фактор транскрипции, принадлежащий к семейству В белков с основной конфигурацией (доменом) спираль-петля-спираль (bHLH). MIST1 экспрессируется в серозных экзокринных клетках, включая ацинарные клетки поджелудочной железы. Вне поджелудочной железы MIST1 экспрессируется в ацинарных клетках слезных, околоушных и поднижнечелюстных слюнных желез, главных клетках желудка, альвеолярных клетках лактирующих молочных желез и секретирующих клетках, выстилающих простату и семенные пузырьки. В поджелудочной железе MIST1 локализуется в ядрах ацинарных клеток. Не наблюдается экспрессии MIST1 в протоковых или центроацинарных клетках. MIST1 является мишенью транскрипционного фактора XBP1, который также играет физиологическую роль в ацинусах поджелудочной железы. Белок MIST1 может также образовывать гетеродимеры с другими факторами транскрипции bHLH, что типично для этих белков. Однако, в отличие от других белков bHLH, MIST1, по-видимому, преимущественно работает как гомодимер.

Экзокринные клетки с выпадением Mist1 гена имеют дефект митохондриальной локализации и движения кальция, что, вероятно, является основной причиной снижения базального и регулируемого экзоцитоза, проявляемого этими клетками. При этом репрессируется Atp2c2 (ген, кодирующего секреторный путь Ca 2+АТФаза 2 (SPCA2), который участвует в поступлении кальция из клеточного депо. MIST1 также нацелен на p21 pCIP / WAF, вызывая задержку роста ацинарных клеток, что позволяет предположить, что в отсутствие MIST1 фенотип зрелых ацинарных клеток более пластичен. Также может наблюдаться спонтанный панкреатит и большая чувствительность к разным повреждающим факторам.
MIST1 также снижает способность онкогенного Kras вызывать PanIN. Отсутствие MIST1 в присутствии KrasG12D значительно ускоряет образование PanIN, и в эксперименте мыши становятся нежизнеспособными из-за почти полного отсутствия ацинарной ткани, замещенной протоковым эпителием. Эти аффекты отменяются принудительным выражением MIST1. Mist1 также активирует экспрессию p21 CIP1 / WAF1 посредством уникального пути Sp1.

Gata6 необходим для терминальной дифференцировки и гомеостаза ацинарных клеток и установления полярности и его инактивация вызывает массовую потерю ацинарных клеток, способствуя развитию ADM в поджелудочной железе. GATA6, среди других генов, кодирующих TF, определяющих судьбу энтодермальных клеток, подавляется в плоскоклеточном подтипе PDAC посредством гиперметилирования промотора. В соответствии с этим, экспрессия GATA6 преимущественно выявлялась в хорошо дифференцированных опухолях низкой степени злокачественности.

Продолжим.

Многочисленные сигнальные пути через стимулированные рецепторы факторов роста передают свои последующие эффекты через факторы обмена гуанином RAS (RAS-GEFs), которые активируют белки семейства RAS, KRAS, HRAS и NRAS. Напротив, негативные регуляторные пути индуцируют белки-активаторы ГТФазы RAS (RAS-GAP), которые осла***ют передачу сигналов RAS. Онкогенные мутации KRAS - в кодонах 12, 13 и 61 - продуцируют конститутивно активные формы KRAS, устраняя необходимость в восходящих индуцирующих сигналах и делая белок нечувствительным к ингибированию. Активированный KRAS задействует множество эффекторных путей, в частности, киназу, активированную митогеном RAF (MAP-киназу), фосфоинозитид-3-киназу и пути RalGDS.

В дополнение к роли в инициации опухоли, похоже, что активация KRAS необходима для поддержания онкогенного роста установленного PDAC, поскольку нарушение активности KRAS - через интерференцию РНК, антисмысловую РНК или экспрессию доминантно-отрицательного KRASN17 - осла***ет онкогенность клеточных линий PDAC. Следовательно, активность KRAS, по-видимому, необходима на всех этапах канцерогенеза протоков поджелудочной железы, и, таким образом, активированный KRAS или его эффекторы, вероятно, будут подходящими мишенями для профилактики и лечения этого злокачественного новообразования.

Экспрессия онкогенного Kras в ацинарных клетках индуцирует трансдифференцировку в протоковые клетки во время ADM; этот процесс предшествует формированию повреждений PanIN и в конечном итоге вызывает PDAC. Инициация PDAC может также развиваться отдельно от ацинарных или протоковых клеток по PanIN-независимому механизму. Сходным образом экспрессия Kras G12D в сочетании с гаплонедостаточностью Smad4 ведет к последовательному прогрессированию поражений MCN в сторону отдельного класса PDAC.

Ptf1α поддерживает идентичность ацинарных клеток и сдерживает Kras-опосредованный туморогенез. Тем не менее, Ptf1a подавляется во время индуцированного воспалением ADM и в ацинарных клетках, трансформированных совместной активацией KrasG12D и Notch. В частности, подавление Ptf1a является необходимым и ограничивающим скорость шагом в ADM и неопластической прогрессии до PanINs и PDAC. Кроме того Ptf1a эпигенетически замалчивается в клетках ADM и PDAC, несущих онкогенный аллель Kras.

FoxA2 считается пионерским фактором, отвечающим за открытие хроматина регуляторных областей генов. Его сайты связывания расположены в регуляторной области гена Pdx1, за счет чего происходит активация последнего. Активация Pdx1 также может происходить по пути Hnf1β-Hnf6-Pdx1. FoxA2 также влияет на экспрессию гена SOX9, впрочем Pdx1 также связывается с регуляторной областью гена SOX9, и наоборот, что указывает на возможность взаимной регуляции экспрессии друг друга. Однако зависимость экспрессии Pdx1 от SOX9 наблюдается на более поздних стадиях, где Pdx1 не силен. Отмечу, что SOX9 для поджелудочной железы также является пионерским фактором транскрипции. Sox9 и второй фактор протока поджелудочной железы, Onecut1, эктопически экспрессируются в метапластических ацинарных клетках в непосредственной близости от поражений PDAC. Поддержание экспрессии генов SOX9 и Pdx1 может также происходить за счет авторегуляции.

Ген Pdx1 часто подавляется гиперметилированием во время прогрессирования в сторону плоскоклеточного подтипа PDAC. С другой стороны, PDX1 является частью транскрипционной сети, определяющей судьбу клеток энтодермы в сторону поджелудочной железы, и его присутствие приводит к лучшему прогнозу для подтипа предшественников PDAC. Но в целом (и не он один) Pdx1 действует как контекстно-зависимый TF во время инициации и прогрессирования PDAC: он переключается с защиты идентичности ацинарных клеток во время раннего туморогенеза на онкоген после установления ADM.

Экспрессия Sox9 в поджелудочной железе взрослого человека ограничена цитокератин-положительными клетками протока, включая центроацинарные клетки. Во время опухолеобразования было показано, что Sox9 индуцируется в ADM и PanIN и поддерживается в подтипе PDAC предшественника поджелудочной железы (классический вариант). Важно, что ADM и PanINs, происходящие из ацинарного компартмента, нуждаются в эктопической индукции Sox9. Совместная экспрессия онкогенного Kras и Sox9 дикого типа способствует индукции предшественников поражений из ацинарного компартмента. В целом ADM, зависит от комбинированной экспрессии Sox9 и Hnf6, поскольку сверхэкспрессия Hnf6 также запускает ADM.
Сверхэкспрессия SOX9 не влияет на частоту IPMN, но снижает риск образования PDAC, в том числе благодаря тому, что Sox9 является основной нижестоящей мишенью Arid1a (AT-rich interacting domain-containing protein 1A), части комплекса ремоделирования хроматина SWI/SNF (см. выше) и предотвращает прогрессирование опухоли, способствуя протоковой дифференцировке. В конце концов, Sox9 является критическим медиатором идентичности протоков или их предшественников. Из-за его встраивания в множественные сигнальные пути и петли обратной связи в спецификации клеточного типа, его дерегулированная экспрессия в конечном итоге связана с ранним туморогенезом.

В поджелудочной железе взрослых экспрессия Notch мишени Hes1 (hairy and enhancer of split-1) ограничена центроацинарными и протоковыми клетками, при этом регуляция Hes1 с помощью активной передачи сигналов Notch наблюдалась во время формирования ADM и PanIN. Гены Hes кодируют ядерные белки, подавляющие транскрипцию, и Notch-индуцированный Hes1 контролирует рост недифференцированной популяции клеток, а активация Notch сенсибилизирует ацинарные клетки к мутантному Kras-индуцированному инициированию и прогрессированию ADM / PanIN.
Кстати, при потере Hes1 может произойти ускорение онкогенеза PDAC за счет образования опухоли по прямому пути от ADM к PDAC, который пропускает предраковые поражения PanIN.

Таким образом, формирование PDAC зависит от ранних предопухолевых событий, таких как ADM, который основан на подавлении TF, которые контролируют идентичность ацинарных клеток, включая Gata6, Mist1 и Ptf1α, и прироста TF, которые способствуют протоковой спецификации, включая Pdx1, Sox9 и Hes1. Клетки ADM также приобретают свойства, не похожие на протоки, за счет активации Pdx1, приобретая более сходные с клетками-предшественниками характеристики.

Активация определенных нижестоящих медиаторов KRAS способна способствовать переходу к плоскоклеточному (сквамозному) подтипу. Сверхэкспрессия Etv1 (Variant Transcription Factor 1, участвует в хромосомных транслокациях, которые приводят к множественным гибридным белкам) индуцирует все основные EMT-TF и молекулярные маркеры, связанные с мезенхимальным фенотипом (например, Vim, Mmp3 и Mmp9), тогда как нокдаун Etv1 снижает уровни Zeb1. Отметим, что в норме Zeb1 является критичным для спецификации клонов эмбриональных клеток в правильных соотношениях и для тканевого гомеостаза в поджелудочной железе взрослых, а в PDAC способствует метастазированию. Также повышение HAS2 (Hyaluronan Synthase 2) способно подпитывать самоподдерживающуюся петлю обратной связи CD44 и ZEB1, дополнительно способствуя EMT. Отмечу, что гиалуроновая кислота (ГК), рецептором которой и является CD44 (см. выше), обеспечивает межклеточную матрицу, через которую клетки могут мигрировать.

Повышающая регуляция MAPK или инактивация TP53 приводит к сверхэкспрессии KLF7, способствуя росту опухоли и метастазированию. Экспрессия KLF7 стабилизирует целостность аппарата Гольджи и, таким образом, гликозилирование белков для усиления секреции факторов роста, способствующих развитию рака.

Yap1 ( (yes-associated protein 1) это регулятор транскрипции, который является критической нижестоящей регуляторной мишенью в сигнальном пути Hippo и играет ключевую роль в контроле размера органа и подавлении опухоли за счет ограничения пролиферации и стимулирования апоптоза. В сотрудничестве с Myc Yap1 поддерживает экспрессию метаболических генов, необходимых для пролиферации и выживания. При удалении Yap1 подмножество опухолевых клеток было способно восстанавливать уровни Myc, обеспечивая выживание клеток за счет индукции генов, кодирующих EMT-TFs Snail, Zeb2, Twist2 и фактор стволовости Sox2, тем самым компенсируя потерю Yap1.

При а***ции KrasG12D были идентифицированы другие компенсаторные механизмы, включая индукцию репрессора транскрипции Gli2, нижестоящего медиатора пути SHH (Sonic hedgehog). При этом индукция GLI2 способствует переключению сигнатуры гена с панкреатического предшественника на плоскоклеточный подтип, что сопровождается снижением маркеров эпителиальной идентичности (E-кадгерин, ESRP1, GATA6 и SHH) и повышением экспрессии EMT / маркеров стволовости (ZEB1, VIM, CK14, SOX2 и CD44).

Продолжим.

Рост первичной опухоли и метастатический рост также можно подавить путем удаления SPP1 (секретируемый фосфопротеин 1), нижестоящей мишени GLI2, что подчеркивает его роль в повышении агрессивности опухоли. Синтезируемый SPP1 белок остеопонтин является внеклеточным структурным белком и органическим компонентом кости, но не только. Кстати, остеопонтин также вызывает чрезмерное образование рубцов, и был разработан гель, препятствующий его действию.
Остеопонтин при PDAC экспрессируется как один из трех вариантов сплайсинга , при этом остеопонтин-а экспрессируется почти во всех PDAC, экспрессия остеопонтина-b коррелирует с выживаемостью, а остеопонтин-с коррелирует с метастатическим заболеванием. Хотя точные механизмы передачи сигнала остеопонтином при PDAC мало изучены, он связывается с CD44 и интегринами, запуская такие процессы, как прогрессирование опухоли и ингибирование комплемента.
Остеопонтин также стимулирует метастазирование, вызывая высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и матриксной металлопротеазы (MMP), которые ингибируются путем нокдауна остеопонтина. Этот процесс стимулируется никотином, который является предполагаемым механизмом, с помощью которого курильщики испытывают повышенный риск РПЖ. Разрабатываются антитела против остеопонтина, в том числе hu1A12, которые ингибировали метастазирование в исследовании in vivo, а также при гибридизации с антителом против VEGF бевацизумабом.

Плоскоклеточный подтип обнаруживает обогащение для передачи сигналов TGFβ; центральным игроком в канонической передаче сигналов TGFβ является SMAD4 (см. выше). Гетерозиготная инактивация Smad4 способствует прогрессированию и росту первичной опухоли, в то время как потеря оставшегося аллеля дикого типа приводит к высокометастатическому заболеванию. Runx3 способствует метастатической колонизации, но зависит от состояния Smad4.

Повышенная регуляция пионерского фактора FOXA1 связана с классическим подтипом РПЖ, тогда как его экспрессия низка при «плоскоклеточном» (квазимезенхимальном) подтипе. Оба этих подтипа впрочем являются сильно метастатическими, с небольшими различиями в общей выживаемости пациентов. Белок регулятора транскрипции BACH1 помимо репрессии FOXA1 активирует SNAI2, который дополнительно способствует EMT, что оценивается по инактивации генов в линиях клеток человека.

Также во время туморогенеза HNF4α напрямую активирует HNF1A, а потеря первого делает возможным переход к более плоскому фенотипу. Более того, HNF4α непосредственно репрессирует мезодермальные и нейральные дифференцировочные TF SIX1 / 4, повышенная экспрессия которых связана с плоскоклеточным подтипом.

HNF1α подавляет активность ингибиторов апоптоза и модулирует экспрессию генов клеточного цикла. Но, с другой стороны, HNF1A является онкогеном, необходимым для регуляции популяций раковых стволовых клеток (CSC) в PDAC, способствует независимому от закрепления клеток росту, пролиферации, а также инвазивной и миграционной способности. Эти противоречивые данные могут быть объяснены гипотезой о том, что клеточная пластичность и, следовательно, способность индуцировать частичную EMT необходима для приобретения стволовости, тогда как обращение к эпителиальному фенотипу является критическим для роста метастазов. Таким образом, повторная экспрессия TF, связанных с подтипом предшественников поджелудочной железы, важна для успешной колонизации печени.

Также Prrx1a (Paired related homeobox 1) усиливает самообновление, снижает инвазивность и способствует метастатическому разрастанию. Изоформа b, с другой стороны, способствует инвазии, EMT и дедифференцировке, способствуя экспрессии Hgf, предполагая, что обе изоформы отчетливо регулируют EMT и MET с образованием явных метастазов. Кроме того, эти две изоформы могут образовывать гомо- и гетеродимеры, влияя на транскрипционную активность. Отметим, что генетическая делеция Prrx1 переводит фибробласты CAF в высокоактивированное состояние, что приводит к повышенному отложению ECM. Этот специфический фенотип CAF приводит к улучшенной дифференцировке опухоли, повышенной чувствительности к химиотерапевтическому лечению и нарушает системную диссеминацию опухоли.

Истощение глутамина способствует метастазированию за счет индукции EMT за счет активации Snai2 посредством передачи сигналов ERK и активации ATF4. А одновременная инактивация Snai1 и Twist вызывает сдвиг EMT-равновесия в более эпителиально-подобное состояние в первичной опухоли, одновременно усиливая метастазы в печень. В целом усиление эпителиальных свойств и, следовательно, клеточной пластичности необходимо для метастатической компетентности.

В совокупности эти находки и исследования основных EMT-TF при других формах рака показывают, что их индивидуальный вклад в инвазию и метастазирование сильно зависит от клеточного контекста, то есть в первую очередь эпигенетики. Так, геномный анализ PDAC человека показал, что до 10% мутаций выявляются в генах ремоделирования хроматина. Более того, эпигенетический ландшафт PDX показал, что подтипы предшественников плоскоклеточного и панкреатического генов также можно классифицировать по паттернам метилирования ДНК и регуляторным элементам генов. В частности, мутации гистонолизиндеметилазы 6a (KDM6A) в сочетании с изменениями p53 были связаны с плоскоклеточным подтипом PDAC. Потеря только KDM6A достаточна для индукции плоскоклеточного подтипа за счет активации участков энхансеров ΔNp63 (TP63), MYC и RUNX3.

Активация гистон-метилтрансферазы Nsd2 увеличивает глобальное накопление метки активации H3K36me2, тем самым обогащая сигнатуру плоскоклеточных генов. Напротив, потеря Nsd2 снижает H3K36me2, что приводит к обогащению маркеров подтипа предшественников поджелудочной железы. Эти находки указывают на то, что накопление диметилирования в H3K36 необходимо для клеток, чтобы претерпевать EMT. Интересно, что H3K36me2 транскрипционно влияет на активность энхансеров и, таким образом, на экспрессию большинства генов ЕМТ-ТФ (Zeb1 / 2, Snai1 и Twist2) и других ТФ, способствующих метастазированию (см. выше).

Эпигенетическая регуляция также необходима для преодоления подавляющих опухоль эффектов передачи сигналов TGFβ, то есть индуцированного старения и апоптоза, прежде чем он сможет действовать как триггер индукции EMT. Поразительно, что повышение NFATc1 (Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1) имеет pешающее значение для преодоления TGFβ-индуцированной остановки роста за счет противодействия H3K27ac модуляции и активации генов-мишеней TGFβ, включая Birc5, Ccnd1 и Plk1.

В целом эпигенетические состояния определяют молекулярные подтипы PDAC в очень динамичном процессе. Изменения в эпигенетическом ландшафте являются ключевыми особенностями прогрессирования PDAC в сторону злокачественности, поддерживая приобретение клеточной пластичности.

Считается, что РПЖ происходит в основном из ацинарных клеток, чувствительных к мутантному KRAS, но хотя при РПЖ эти клетки претерпевают изменения, больше дистрофические, но так как РПЖ обычно является следствием многократно повторяющего воспаления (явного или скрытого), то ацинарные клетки при этом метаплазируют скорее в подобие центроацинарных клеток, образуя как бы разветвленный воротник вокруг ацинуса. Со временем вследствие накапливающихся мутаций связи между клетками в этом воротнике слабеют и он разрывается, образуя клеточные обрывки. Эти обрывки и дают начало раку, большая их часть попадает под власть генов-предшественников и далее дают начало классическому подтипу, меньшая часть превращается в псевдомезенхимальные клетки и дает начало сквамозному (плоскоклеточному) подтипу (см. выше).

Так как все начинается с воспалительной реакции, то рассмотрим поподробней основных участников этих как бы старых песен о главном. В начальной стадии онкогенеза важнейшую роль играет NF-κB, причем в предраковых клетках p65-субъединица NF-κB функционирует как супрессор опухолей, но затем экспрессия онкогенного Ras заставляет p65 переключать свою функцию на промотор опухоли, чтобы защитить трансформированные клетки от иммунного надзора. Отметим, что NF-κB конститутивно активируется при раке поджелудочной железы, и имеются существенные доказательства, подтверждающие его участие в образовании плотной стомы с инфильтрацией врожденными иммунными клетками.

NF-κB способен модулировать воспалительные макрофаги через прямое регулирование GDF-15 (growth differentiation factor 15), который впервые был идентифицирован как ингибирующий макрофаги цитокин-1 путем негативной регуляции фактора роста TGF-ß, который активирует киназу 1 (TAK1), что, в свою очередь, вызывает подавление экспрессии целевых генов NF-κB Tnf и iNOS. В отсутствие TNF и NO макрофаги больше не способны уничтожать опухолевые клетки.

Хроническое воспаление может привести к выработке провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6), который активирует специфические рецепторы, например пути Janus-Kinase-Signal Transducer и Activator of Translation3 (JAK-STAT3), митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK) и способствует развитию PanIN.
Миофибробластоподобные панкреатические звездчатые клетки (PSC) находятся в состоянии покоя в нормальной поджелудочной железе, но переходят в активированное состояние при патологических состояниях, таких как воспаление или рак. Секреция PSC содержит высокий уровень IL-6.

IL-6-JAK2-STAT3 способствует росту и развитию поджелудочной железы. Это естественным образом ингибируется SOCS3, который в целом предотвращает пролиферацию клеток. Во время онкогенеза сдерживающее действие SOCS3 снимается посредством гиперметилирования его промотора ДНК-метилтрансферазой 1.
IL-6 может также независимо активировать Pim-1-киназу, протоонкогенную мишень STAT3. Связанная с прогрессированием клеточного цикла и контрольными точками G1 / S и G2 / M, Pim-1-киназа необходима для пролиферации клеток. Активация IL-6 через STAT3 придает клеткам ПК резистентность к аноикису, что в конечном итоге усиливает метастазирование.

Воспаление поджелудочной железы приводит к связанным с повреждением молекулярным паттернам (DAMPs) и активации факторов роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) во время последующего заживления. DAMP, возникающие в результате воспаления и повреждения клеток, могут стимулировать TLR и, следовательно, индуцировать передачу их сигналов, что поддерживает воспалительное микроокружение. DAMP, также известные как alarmins, представляют собой молекулы, высвобождаемые стрессированными клетками, подвергающимися некрозу, которые действуют как эндогенные сигналы опасности, способствуя и усиливая воспалительный ответ.

Toll-подобные рецепторы (TLR) являются мембранными рецепторами, способствующими распознаванию образов врожденной иммунной системы. Передача сигналов TLR2 и TLR4 опосредует активацию NF-κB. Было показано, что синергизм с TLR4 опосредует эффекты DAMP HMGB1 и HSP70. Триггерный рецептор (TREM-1) является новым членом суперсемейства иммуноглобулинов, присутствующих в моноцитах и ​​нейтрофилах. TREM-1 является положительным регулятором воспалительных реакций.

Эндогенные лиганды, такие как белки теплового шока, фибриноген и фрагменты гиалуроновой кислоты, возникающие в результате повреждающих событий, вызванных воспалительными процессами, индуцируют TLR2, -4 и -9. Сигнализации TLR4 активирует PI3K-Akt путь, тем самым вызывая секрецию раковыми клетками различных воспалительных медиаторов и цитокинов. TLR4 стимулирует ангиогенез рака поджелудочной железы посредством повышающей регуляции VEGF через PI3K -АКТ.

Фактор некроза опухолей-α (TNF-α) является основным регулятором воспаления и ключевым игроком в сети цитокинов. TNF-α является трансмембранным белком типа II с сигнальным потенциалом в качестве мембранно-интегрированного белка или в виде растворимого цитокина, высвобождаемого при его протеолитическом расщеплении. Стимуляция TNF-α сильно увеличивает инвазивность с умеренным антипролиферативным эффектом.
Существует два конкретных обьекта для TNF-α: TNFR1 и TNFR2. Активация TNFR1 вызывает образование каспазсодержащих комплексов и через множество сложных путей, включая активацию проапоптотических белков семейства Bcl-2 и апоптоз, индуцирует активные формы кислорода (АФК).

IL-1-α при раке поджелудочной железы экспрессируется исключительно злокачественными клетками опухоли и его высокая экспрессия связана с плохим клиническим исходом. В присутствии IL-1-α в PSC индуцировался специфический профиль экспрессии, который характеризовался повышенной экспрессией MMP1 и MMP3, а также сниженными уровнями MMP2, TIMP2 и TIMP3. Ранее было обнаружено, что TIMP3 преимущественно ингибирует активность MMP1 и MMP3, и снижение экспрессии TIMP3 может усиливать их протеолитическую активность, что приводит к ремоделированию опухолевой стромы.

IL-4 может оказывать стимулирующее рост и проинвазивное действие в некоторых раковых опухолях, включая поджелудочную железу. Он обнаружен в большом количестве в окружении опухолевых клеток и секретируется инфильтрирующими лимфоцитами, а также самими опухолевыми клетками. Было показано, что избыточная экспрессия одной из его рецепторных цепей, IL-4Rα была связана с местно-распространенной стадией опухоли, повышенной склонностью к метастазированию и плохой общей выживаемостью.