Новая теория рака. 2-ая редакция

[albert52]

Продолжим.

В тройном негативном раке базально-подобный рак молочной железы (BLBC) является особенно агрессивным молекулярным подтипом, определяемым мощным кластером генов, экспрессируемых эпителиальными клетками в базальном или наружном слое взрослой молочной железы. В отличие от ER-положительных просветных опухолей и HER2-положительных опухолей, у базально-подобного подтипа обычно отсутствует экспрессия молекулярных мишеней, которые придают чувствительность высокоэффективным таргетным препаратам, таким как тамоксифен и ингибиторы ароматазы (ER) или трастузумаб (амплификация HER2).
Отметим, что тройные негативные опухоли, которые экспрессируют базальные маркеры, имеют отчетливые молекулярные повреждения ( например, нокдаун p53 и более высокие митотические показатели) и связаны с худшей выживаемостью, чем тройные отрицательные опухоли, в которых отсутствуют базальные маркеры .

BLBC чаще встречается у африканцев и афроамериканцев, а также у молодых женщин и женщин в пременопаузе (особенно среди афроамериканцев). Заболеваемость BLBC обратно пропорциональна продолжительности лактации. В отличие от опухолей просвета, BLBC чаще встречается у женщин с ранним началом менархе и первой доношенной беременностью до 26 лет. Хотя не было показано, что индекс массы тела достоверно связан с BLBC, как это имеет место для других молекулярных подтипов, повышенное соотношение талия-бедро положительно связано с BLBC у женщин в пременопаузе.

Несмотря на то, что опухоли TNBC / BLBC часто имеют большие опухоли на поздней стадии, они могут быть более чувствительными к предоперационной химиотерапии, о чем свидетельствуют более высокие показатели (22–45%) полного патологического ответа ( т. е. сами опухоли не обнаружены во время операции). Также среди пациентов с ER-отрицательным раком молочной железы (подтипы TNBC и HER2) в возрасте до 50 лет частота рецидивов в течение 5 лет в необработанной когорте составляет 38,8%, что снижается до 25,5% при комбинированной химиотерапии.
Важно отметить, что у пациентов, которые достигают патологического полного ответа, показатели выживаемости аналогичны показателям пациентов без TNBC / BLBC. Однако большинство женщин с TNBC / BLBC не имеют полного ответа и имеют высокий риск раннего рецидива в течение первых 2–5 лет после лечения, что приводит к общей более низкой 5-летней выживаемости.

TNBC / BLBC имеет характерный паттерн органоспецифических отдаленных метастазов с легкими, печенью и центральной нервной системой в качестве предпочтительных участков. Особенно разрушительным аспектом TNBC является высокая частота метастазов в паренхимe центральной нервной системе , которые наблюдаются у 46% женщин с метастатическим TNBC (6,7–9,6% всех случаев TNBC) и связаны с медианой выживаемости менее 5 месяцев с момента постановки диагноза.

Женщины с инактивирующими мутациями зародышевой линии в BRCA1 или BRCA2 имеют до 85% вероятности развития рака молочной железы в течение жизни. Потеря гетерозиготности (LOH) второго BRCA½ аллеля в эпителии молочной железы приводит к нарушению репарации двухцепочечной ДНК с помощью высокоточного пути репарации гомологичной рекомбинации. Вместо этого клетки полагаются на негомологичное соединение концов, которое подвержено ошибкам и может привести к хромосомным транслокациям, потому что репарация не связана с поврежденной последовательностью сестринской хроматиды ДНК.
Обычно наличие повреждения двухцепочечной ДНК приводит к остановке клеточного цикла и гибели клеток, но при наличии мутаций р53 остановка контрольной точки отменяется, что приводит к широкой нестабильности генома и анеуплоидии.

Спорадические фенотипы BLBC во многих аспектах наследственного рака молочной железы возникают у носителей BRCA1 (но не BRCA2 ). В частности, опухоли молочной железы у носителей BRCA1 и ненаследственного BLBC имеют следующие особенности:
1) они в основном носители тройного отрицания и базальны по профилю экспрессии генов и суррогатам биомаркеров;
2) они характеризуются высокой степенью развития опухоли, высокими митотически -ми показателями, мутациями р53 и хромосомной нестабильностью;
3) они часто имеют аномалии Х-хромосомы, включая дефекты в инактивации Х-хромо -сомы, хорошо известную функцию BRCA1;
4) они имеют сходные клинические признаки, в том числе молодой возраст на момент представления, плохой прогноз, ранние рецидивы и благоприятный ответ на химиотерапию, повреждающую ДНК.

Мутационная инактивация BRCA1 редко встречается при спорадическом раке молочной железы, а инактивация путем метилирования промотора CpG-острова, часто в комбинации с BRCA1 LOH наблюдается в 11–13% спорадических раков молочной железы, большинство из которых являются ER-негативными опухолями. Кроме того, было показано, что доминантно-негативный регулятор транскрипции ID4 регулирует экспрессию BRCA1 и преимущественно экспрессируется в BLBC.

BLBC также имеет высокую частоту (44–82%) мутаций TP53 , которые нарушают активацию и апоптоз контрольных точек, вызванные повреждением ДНК, тем самым способствуя нестабильности генома. Также EGFR рецепторная тирозинкиназа экспрессируется в 39–54% BLBC и придает устойчивость к апоптозу за счет лиганд-зависимой активации пути фосфатидилинозитол-3 (PI3) -киназа / Akt / mTOR.
Другой характерной апоптотической аномалией в BLBC является экспрессия молекулярного шаперона αB-кристаллина, который подавляет апоптоз путем ингибирования протеолитической активации проапоптотической протеазы каспазы-3. αB-Кристаллин экспрессируется в 45% BLBC и лишь редко (5%) в других молекулярных подтипах. Примечательно, что экспрессия αB-кристаллина связана с устойчивостью к предоперационной химиотерапии и плохой выживаемостью у пациентов с раком молочной железы.

Недавно определенная клаудиновая сигнатура с низкой экспрессией генов характеризуется низкой экспрессией генов клеточной адгезии ( например, Claudins и E-cadherin ), что приводит к фенотипу EMT. Опухоли с низким уровнем клаудина, наиболее тесно связанные с базисоподобным подтипом, обычно являются ER и HER2-отрицательными; такие опухоли составляют отдельный внутренний подтип экспрессии генов.

Фактор роста сосудистого эндотелия А (VEGFA / VEGF) является мощным митогеном для эндотелиальных клеток и регулирует ангиогенез опухоли и проницаемость сосудов, тем самым способствуя росту первичной опухоли и метастазированию. VEGF экспрессируется в приблизительно в 3 раза более высоких уровнях в TNBC по сравнению с не TNBC; ген VEGF расположен в хромосомной области (6p21.2–6p12.3), для которой в TNBC характерно частое увеличение числа копий.

В концепция синтетической летальности два онкогенных пути находятся в синтетической летальной взаимосвязи, если мутация любого онкогена хорошо переносится, но мутация обоих приводит к гибели клеток. Так, PARP и BRCA½ находятся в синтетических летальных отношениях: ингибиторы PARP потенциально индуцируют гибель клеток только в раковых клетках с мутациями в BRCA1 или BRCA2. Действительно, мутации в BRCA1 или BRCA2 придают 57- и 133-кратное увеличение чувствительности к ингибиторам PARP по сравнению с клетками с BRCA1 или BRCA2 дикого типа.

Дело в том, что лекарственные ингибиторы поли (АДФ) рибозо-полимеразы (PARP), фермента, участвующего в репарации ДНК-оснований, предотвращают восстановление одноцепочечных разрывов ДНК, которые превращаются в двухцепочечные разрывы на остановленных вилках репликации ДНК. Эти разрывы двухцепочечной ДНК обычно восстанавливаются с помощью BRCA½-опосредованного гомологичного рекомбинационного восстановления, и для клетки нет н***агоприятных последствий. Однако в присутствии BRCA1 или BRCA2 мутации, этот механизм репарации является дефектным: клетки накапливают двухцепочечные разрывы ДНК и в конечном итоге подвергаются апоптозу.

[albert52]

Продолжим.

Предшественники и преинвазивные поражения груди включают атипическую протоковую гиперплазию (ADH), протоковую карциному in situ (DCIS) и дольчатую неоплазию (LN). ADH - редкое заболевание, обнаруживаемое в 4% клинических доброкачественных биопсий, и по сути это небольшой очаг гиперплазии размером менее 2–3 мм. Значение диагноза ADH заключается в повышенном риске последующей инвазивной карциномы молочной железы IDC (относительный риск RR = 4,4).

Когда ADH сочетается с положительным семейным анамнезом, относительный риск инвазивного рака достигает 9,7. Основная проблема, связанная с ADH, - это трудность достижения приемлемого уровня соответствия или последовательности в диагнозе; так, пролиферация на краю биопсии может представлять собой периферию DCIS.

DCIS определяется как пролиферация злокачественных эпителиальных клеток в паренхиматозных структурах груди без признаков инвазии через базальную мембрану. В настоящее время DCIS составляет 15–20% злокачественных новообразований груди, выявляемых при скрининге, и известно, что такой диагноз повышает риск развития IBC (воспалительный рак груди) в 8-10 раз. Исследования показывают, что до 50% пациентов с микроскопическими очагами DCIS заболевают инвазивной карциномой, причем развитие инвазии связано с подтипом DCIS; комедонная форма (с кистами) прогрессирует в инвазивную карциному чаще и быстрее, чем DCIS низкой степени злокачественности. По данным маммографического скрининга, компонент DCIS присутствует в 30–60% IDC, причем пациенты с раком IDC с компонентом DCIS могут иметь менее агрессивное заболевание, чем у пациентов с чистой IDC груди.

LN характеризуется пролиферацией обычно мелких и часто слабо связанных клеток. Термин LN относится ко всему спектру атипичных эпителиальных пролифераций, возникающих в терминальной протоковой долевой единице (TDLU), с или без вовлечения терминальных протоков. При этом для оценки степени поражения используются термины ALH (атипичная дольчатая гиперплазия) и LCIS (лобулярная карцинома in situ); ALH увеличивает риск развития IBC в 3 раза, тогда как LCIS имеет относительный риск, равный 7.

В нормальной груди в пременопаузе ER (+) клетки составляют 7% от общей популяции эпителиальных клеток и равномерно распределены в просветном эпителии. Их число увеличиваются с возрастом, достигая плато после менопаузы. Экспрессия ER-альфа значительно повышена в гиперпластически увеличенной лобулярной единице (HELU), которая представляет собой самое раннее гистологически идентифицируемое поражение с предраковым потенциалом. Напротив, что касается увеличенных дольчатых единиц с столбчатым изменением (ELUCA), то более интенсивное окрашивание ER-альфа было связано с более низким риском последующей инвазивной карциномы.

В DCIS диптих ER (+) / Ki-67 (+) является отличительной чертой; при этом высокое соотношение ER-альфа / ER-бета при неатипичной эпителиальной гиперплазии, по-видимому, предсказывает прогрессирование до карциномы.

Подобно рецепторам эстрогена, рецепторы прогестерона (PR) повышены на очень раннем этапе предраковых поражений груди, а именно в (HELU). С другой стороны, зарегистрирована тенденция к снижению экспрессии PR при прогрессировании до злокачественного новообразования. При этом соотношение рецептора прогестерона A (PRA) / рецептора прогестерона B (PRB), по-видимому, играет центральную роль. В нормальной ткани молочной железы и неатипичной гиперплазии рецепторы гомогенно коэкспрессируются, но в начале прогрессирования один рецептор (особенно PRA при запущенных поражениях) преобладает. Следует отметить, что в нормальной ткани носителей мутации BRCA изоформа PRB совершенно отсутствует.

14-3-3 сигма это ген, экспрессия которого теряется при карциномах молочной железы, в первую очередь из-за опосредованного метилированием молчания. Он является негативным регулятором клеточного цикла и специфический маркером эпителия молочной железы человека, который подавляется в трансформированных клетках карциномы молочной железы. Он также был идентифицирован как продукт гена, индуцируемого р53, участвующий в контроле контрольных точек клеточного цикла после повреждения ДНК.

Важно отметить, что гиперметилирование локуса 14-3-3 сигма отсутствовало при гиперплазии без атипии, но выявлялось с возрастающей частотой по мере прогрессирования поражений груди от атипичной гиперплазии до DCIS и, наконец, до инвазивной карциномы. Метилированные аллели существовали также в перидуктальной стромальной ткани молочной железы.

Bcl-2 присутствует во всем спектре поражений молочной железы: преимущественно в доброкачественных поражениях, ADH, LN и хорошо дифференцированной DCIS. Более конкретно, наблюдается постепенное увеличение степени апоптоза и параллельное снижение экспрессии Bcl-2 в доброкачественных / предшественниках / преинвазивных / инвазивных поражениях по мере того, как они становятся гистологически более агрессивными.

BCL-2 локализован на внешней мембране митохондрий, где он играет важную роль в обеспечении выживания клеток и подавлении действия проапоптотических белков, включая члены его семейства. Проапоптотические белки семейства BCL-2, включая Bax и Bak , обычно действуют на митохондриальную мембрану, способствуя проницаемости и высвобождению цитохрома C и ROS , которые являются важными сигналами в каскаде апоптоза.

Bcl-2 в процессе апоптоза тесно взаимодействует с р53. Апоптоз, стимулированный р53, опосредуется двумя основными путями апоптоза, включая семейство В-клеточной лимфомы 2 ( Bcl-2) и каспазный каскад. Члены семейства Bcl-2 включают «мультидоменного» проапоптического члена семейства Bcl-2 Bax и членов «только BH3» Puma, Noxa и Bid. Домен BH3, короткий пептидный мотив, обнаруженный в некоторых белках семейства BCL-2, запускает ключевые митохондриальные события, связанные с апоптозом. Эти белки действуют выше Bax и вызывают активацию мультидоменных проапоптотических белков, а также являются прямыми мишенями для транскрипции через p53. р53 сам по себе может действовать как белок BH3 и противодействовать функции Bcl-2.

Преодоление антиапоптотического порога, установленного Bcl-2: p53-зависимые сигналы, включая индукцию «мультидоменного» Bax, и членов «только BH3» Puma и Noxa и прямое ингибирование Bcl-2, взаимодействуют с p53-независимыми сигналами, такими как индукция Bim, чтобы противодействовать функции Bcl-2 и способствовать апоптозу. р53 сам по себе может действовать как белок BH3 и противодействовать функции Bcl-2. Воздействие на клетки известных индукторов p53, таких как химиотерапия, вызывающая повреждение ДНК, или стрессы, которые активируют параллельные пути апоптоза, такие как лишение цитокинов, легко заставляют эти клетки превышать пороговое значение Bcl-2, чтобы вызвать апоптоз.

Напротив, инактивация любого отдельного пути апоптоза в клетках, экспрессирующих онкоген, может обеспечить уровень онкогенной активности, достаточный для стимуляции трансформации и туморогенеза. Так, при гиперплазии эпителия без атипии мутации р53 не обнаружены, но был констатирован мутированный p53 в ADH . Также мутации / накопление p53 присутствуют в значительном проценте DCIS, особенно у комедонов.

[albert52]

Продолжим.

Проапоптический BAK требует дополнительного этапа дефосфорилирования в процессе активации перед взаимодействиями с проапоптотическими белками, содержащими "только BH3", и последующих конформационных изменений, которые запускают BAK-зависимый апоптоз. Исследования показали, что киназа, отвечающая за поддержание BAK в неактивной конформации, представляет собой тирозинкиназу под названием BMX, которая, как сообщается, активируется при многих типах рака, включая рак груди, рак простаты, а также рак мочевого пузыря и другие. При ингибировании ВМХ BAK переходит в дефосфорилированное «активационно компетентное» состояние, которое более склонно к активации.

Фосфорилирование проапоптотического белка BH3 BID с помощью ATM / ATR является определяющим фактором того, подвергается ли клетка апоптозу после остановки митоза. Оказавшись в фосфорилированной форме в митозе, BID является более проапоптотическим, что делает его более зависимым от взаимодействия с белками семейства BCL-2 для его ингибирования и предотвращения апоптоза. Таким образом, фосфорилирование BID «готовит» клетки к апоптозу. Если митоз успешно завершен, происходит дефосфорилирование и снижается чувствительность к апоптозу. На основе этого механизма клетки, остановленные в митозе за счет добавления ингибиторов микротрубочек, таких как пакслитаксол, в сочетании с миметиками BH3, такими как ABT-737 или Navitoclax, значительно более сенсибилизированны к апоптозу.

Отметим, что нацеливание на апоптоз для лечения рака становится все более привлекательной стратегией, поскольку в настоящее время разрабатываются агенты для запуска внешнего апоптоза посредством передачи сигналов TRAIL или для предотвращения антиапоптотической активности белков BCL-2 или белков ингибитора апоптоза (IAP). Хотя уклонение от апоптоза является одним из отличительных признаков рака, многие виды рака имеют интактные сигнальные пути апоптоза, которые, если их разблокировать, могут эффективно убивать раковые клетки.

Напомню, что апоптоз (от греческого «опадание», как листья с дерева) преимущественно протекает двумя разными путями; внешние и внутренние пути апоптоза. Внешний путь инициируется внеклеточными проапоптотическими стимулами, включая лиганды клеточной смерти из семейства цитокинов TNF, которые действуют через рецепторы смерти, расположенные на поверхности клетки. Так, активация TRAIL приводит к его агрегации (TRAIL-R) и образованию DISC, в котором прокаспаза 8 активируется и инициирует апоптоз путем прямого расщепления нижестоящих эффекторных каспаз. Добавление либо агонистических антител TRAIL-R1 / R2, либо рекомбинантного человеческого TRAIL (rhTRAIL) использовалось для запуска внешнего пути апоптоза.

Внутренний путь инициируется внутриклеточными проапоптотическими сигналами, такими как повреждение ДНК или воздействие цитотоксических агентов и регулмруется семейством белков BCL-2, вызывающих образование пор на внешней мембране митохондрий и высвобождение апоптогенных факторов, таких как цитохром c или SMAC, из митохондрий. Высвобождение цитохрома с в цитозоль запускает активацию каспазы 9 за счет образова -ния комплекса апоптосом, содержащего цитохром c / Apaf-1 / каспазу 9. SMAC способствует активации каспаз за счет нейтрализации ингибирующего действия IAP. Каспазы 8 и 9 активируют каспазу 3/7, собственно вызывающую апоптоз.

Важно отметить, что существует перекрестное взаимодействие между двумя путями апоптоза через расщепление каспазой 8 BID, что приводит к усилению сигнала смерти. За активацией каспаз находится еще один уровень регуляции белков-ингибиторов апоптоза (IAP) через SMAC. Х-связанный ингибитор апоптиза (XIAP) способен ингибировать апоптоз путем прямого связывания и ингибирования каспаз 9 и 3/7, тогда как клеточные белки IAP (cIAP) подавляют активность каспазы косвенно через свою активность убиквитинлигазы, способствуя передаче сигналов выживания.

Антиапоптотические белки, включая BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BCL-W и BFL-1 / A1, прерывают этот проапоптотический каскад двумя способами. Во-первых, антиапоптотические белки могут связывать белки-активаторы BH3, предотвращая их взаимодействие и активацию BAX или BAK. Кроме того, антиапоптотические белки могут связываться с мономерными активированными формами BAX и BAK, у которых экспонируются их домены BH3. Это предотвращает гомоолигомеризацию BAX и BAK и, таким образом, предотвращает MOMP и апоптоз.

Так, механизм, лежащий в основе особой зависимости CLL (хронический лимфолейкоз) от BCL-2, связан с высокой экспрессией BCL-2. Однако этот обильный BCL-2 не обеспечивает достаточной защиты от дополнительной проапоптотической передачи сигналов, поскольку он уже занят большими количествами проапоптотического белка BIM. Когда миметик BH3 с небольшой молекулой, такой как венетоклакс, связывается с BCL-2, он замещает BIM, позволяя ему активировать BAX или BAK, вызывая олигомеризацию, MOMP (повышение проницаемости внешней мембраны митохондрий) и гибель клеток.

Когда раковые клетки подвергаются химиотерапии, происходит отбор по снижению чувствительности к апоптозу, что, вероятно, является важным фактором пан-резистентного фенотипа многих рецидивирующих опухолей. Апоптотическая гибель клеток обычно считается менее иммуногенной, чем другие типы гибели клеток, такие как некроз, поскольку быстрый фагоцитоз апоптотических клеток приводит к меньшему воздействию внутриклеточного содержимого на иммунную систему. Однако апоптотическая гибель клеток, тем не менее, может быть иммуногенной, возможно, за счет облегчения презентации антигена. В целом, однако, чем более быстрый и полный ответ in vivo, тем более вероятно, что основным типом гибели клеток является апоптоз, лучше всего документированный при гематологических злокачественных новообразованиях.

Профилирование BH3 - это метод, впервые разработанный для выявления опухолей, выборочно зависящих от отдельных антиапоптотических белков. Суть профилирования BH3 заключается в систематическом воздействии на митохондрии известных концентраций пептидов BH3 (имитируют проапоптотические функции белков, содержащих только BH3) и измерении полученного MOMP, который обычно рассматривается как точка необратимости апоптоза.

Например, митохондрии, чувствительные к пептиду NOXA BH3, зависят от MCL-1, а митохондрии, чувствительные к пептиду HRK BH3, зависят от BCL-XL. Так, пептид венетоклакс используется при CLL с хромосомной делецией 17p; эта делеция приводит к потере p53 и ранее предвещала очень плохой прогноз и отсутствие реакции на химиотерапию. Venetoclax, по-видимому, применяет апоптотический сигнал непосредственно к митохондриям, устраняя необходимость в передаче сигналов p53 для индукции апоптоза.

Наиболее эффективными лекарствами, которые у нас есть для больных раком, по-прежнему остаются обычные химиотерапевтические агенты. Поскольку они нацелены на повсеместные элементы, в основном ДНК и микротрубочки, не сразу понятно, почему они убивают раковые клетки лучше, чем нормальные клетки. Традиционные объяснения основываются на предположении, что скорость деления раковых клеток делает их уязвимыми для таких агентов. Однако клинические данные, подтверждающие это предположение, отсутствуют. Раковые клетки часто не делятся очень быстро in vivo по сравнению с нормальными тканями, а некоторые виды рака, такие как вялотекущие лимфомы, чувствительны к химиотерапии, а делятся очень медленно.

При рассмотрении механизмов терапевтического индекса традиционной химиотерапии рака важно признать, что чувствительность к одному агенту часто означает чувствительность к нескольким. Например, излечимость ОLL у детей зависит не только от чувствительности этого рака к стероидам, но и от его чувствительности к антрациклинам, алкилирующим агентам, алкалоидам барвинка, l-аспаргиназе и 6-меркаптопурину. Напротив, отсутствие вызванных химиотерапией ремиссий при почечно-клеточной карциноме является результатом не только устойчивости к платинам, но и устойчивости к таксанам, алкилирующим агентам, антрациклинам, алкалоидам барвинка и ингибиторам топоизомеразы. Эти наблюдения предполагают, что существует узел, который широко регулирует химиочувствительность.

Можно предположить, что этот узел представляет собой митохондриальный апоптотический путь. Одна из гипотез состоит в том, что все клетки осуществляют проапоптотическую передачу сигналов в ответ на яды ДНК или микротрубочек. Однако некоторые клетки располагаются близко к порогу приверженности апоптозу, тогда как другие располагаются дальше; первые клетки совершают апоптоз, тогда как вторые выживают.

Для проверки этой гипотезы использовалось профилирование BH3 с так называемыми неразборчивыми пептидами BH3, пептидами, которые связывают с высоким сродством все антиапоптотические белки. Чувствительность митохондрий к таким пептидам дает меру общего антиапоптотического резерва и, следовательно, близость к пороговому значению. Клетки или митохондрии, более чувствительные к этим пептидам, называются более праймированными.

В клинических экспериментах с ОМL, ОLL, CLL, множественной миеломой и раком яичников предварительное апоптотическое праймирование образцов рака пациентов предсказывало чувствительность к обычным схемам химиотерапии, предполагая, что дифференциальное праймирование было объяснением, лежащим в основе разной химиочувствительности опухолей. Более того, также обнаружено, что большинство нормальных клеток были очень плохо подготовлены к апоптозу, что дает объяснение терапевтическому индексу химиотерапии, который использовался в течение многих десятилетий.

Единственным исключением из этого наблюдения были белые кровяные тельца, которые относительно сильно праймированы. В этом отношении следует отметить, что потеря белых кровяных телец является очень частой ограничивающей дозу токсичностью большинства химиотерапевтических режимов.

[albert52]

Продолжим.

Ключевым признаком рака является бегство от онкосупрессивных путей , таких как апоптоз, аутофагии и торможение клеточного цикла. Уклонение от апоптоза во время канцерогенеза происходит за счет трех различных механизмов: нарушение передачи сигналов рецепторов смерти, потеря активности каспаз, а также нарушение баланса между антиапоптотическими и проапоптотическими белками. Терапевтические агенты, предназначенные для восстановления нормального функционирования сигнальных путей апоптоза, могут избавить более чем от 50% случаев рака человека, включая рак груди.

Флавипиродол, госсипол, депсипептид, ABT-737, ABT-264, фенретинид, HA 14-1 и GX15-070 - это некоторые из небольших молекул, которые ингибируют BCl-2, снижая их экспрессию. Также были разработаны небольшие молекулы, способные имитировать проапоптотические или антиапоптотические белки семейства BH3-only Bcl-2 для индукции апоптоза. ABT 737 является одним из примеров миметиков, содержащих только BH3, которые ингибируют экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl-xL, Bcl-2 и Bcl-W; первый таргетный препарат против Bcl-2, поступивший в клинические испытания на больных лейкемией, известен как облимерсен натрия.

Также ингмбиторы каспаз IAP являются привлекательными молекулярными мишенями. Некоторые новые методы лечения, направленные на XIAP, включали антисмысловые стратегии и короткие интерферирующие молекулы РНК (siRNA). Ингибирование XIAP привело с помощью лучевой терапии к улучшенному контролю опухоли in vivo. Также цисплатин последовательно снижает содержание XIAP и индуцирует апоптоз в цисплатин-чувствительных клетках.

Механизм действия малых молекул основан на их связывании с конкретными биополимерами, такими как белки и нуклеиновые кислоты, и действует как эффекторы для изменения функции или активности конкретного биополимера. При раке малые молекулы используются для восстановления мутировавших белков до их форм дикого типа и индукции активности белков, ответственных за устранение онкогенных клеток. В лекарственной терапии на основе р53 были исследованы несколько небольших молекул, которые могут восстанавливать функцию мутировавшего р53. Так, APR-246 превращается в активное соединение MQ, которое ковалентно связывается с мутантным p53, преобразовывая его в конформацию дикого типа2 и реактивируя p53-зависимый апоптоз; также дозозависимо снижает внутриклеточные уровни глутатиона.

Другая молекула, CDB3, представляющая собой синтетический пептид, производный от связывающего p53 белка (53BP2), взаимодействует с коровым доменом p53 и усиливает трансактивационную активность p53. Отметим, что после обработки только CDB3 апоптоз не индуцировался в клетках, несущих р53 дикого типа. Тем не менее, клетки показали повышенную чувствительность к апоптозу, индуцированному инфракрасным излучением

Наиболее продвинутыми из этих небольших молекул являются те, которые действуют, прерывая взаимодействие p53-MDM2, которое отвечает за инактивацию p53 дикого типа. К ним относятся нутлины, теновины и MI-219. MDM2 действует как негативный регулятор p53, связываясь с p53 и инактивируя его функцию с помощью ауторегулирующей петли обратной связи MDM2-p53. Эта активность MDM2 приводит к потере р53-опосредованного апоптоза в раковых клетках, что способствует канцерогенезу. Низкомолекулярные препараты MI-219 ответственны за дестабилизацию взаимодействий MDM2-p53, чтобы избирательно индуцировать апоптоз. Также Nutlin2 представляет собой низкомолекулярный ингибитор, который помещается в карман белка р53, где TP53 дикого типа связывается с MDM.

Отметим, что почти все без исключения низкомолекулярные фармацевтические препараты соответствуют «Правилам Липинского», включая высокую липофильность и молекулярную массу не более 500. В отличие от них, miRNA естественным образом не обладают этими лекарственными свойствами из-за их большого размера (два оборота двойной спирали нуклеиновой кислоты), почти 40 анионных зарядов за счет фосфодиэфирного остова и высокий молекулярный вес (более 13 кДа). Кроме того, miRNA нестабильны в сыворотке в результате разложения сывороточными нуклеазами, что способствует их короткому периоду полужизни in vivo. Поэтому используются siRNA дуплексы, имеющие стабильность в 600 раз большую, чем у природной РНК. siRNA могут быть сконструированы таким образом, чтобы соответствовать любому гену, их можно дешево производить и легко вводить в клетки.

Отметим, что эпигенетические модификации осуществляются метилированием ДНК, модификацией гистонов и интерференцией РНК (RNAi). Путь RNAi является обычным для многих эукариотических организмов. Термин «РНК-интерференция» (RNAi) был придуман для описания клеточного механизма, который использует собственную последовательность ДНК гена для его выключения - процесс, который исследователи называют « молчанием». У самых разных организмов, включая животных, растения и грибы, RNAi запускается двухцепочечной РНК (дцРНК) и играет важную роль в защите от вирусных вторжений вирусных нуклеотидов и транспозонов, изменений в развитии и экспрессии гена.

Центральным элементом RNAi являются три типа малых молекул РНК: miRNA, ShRNA и короткая интерферирующая или сайленсирующая РНК (siRNA). Она представляет собой класс молекул двухцепочечной некодирующей РНК , обычно длиной 20-27 пар оснований, подобных miРНК и действующих в рамках РНК-интерференции. Она препятствует экспрессии конкретных генов с комплементарными нуклеотидными последовательностями, разрушая мРНК после транскрипции, тем самым предотвращая трансляцию.

Важнейшими проблемами дизайна при выборе дуплексов siRNA для терапевтического использования являются эффективность и специфичность. В отношении специфичности миРНК есть два основных соображения: «нецелевое» из-за молчания генов, имеющих частичную гомологию с миРНК, и «иммунная стимуляция» из-за вовлечения компонентов врожденной иммунной системы дуплексом миРНК. Эффективность включения направляющей цепи дуплекса в комплекс RISC (РНК-индуцированного сайленсинга), возможно, является наиболее важным фактором, определяющим эффективность siRNA.

Вирусный белок E6 является еще одним тщательно изученным негативным регулятором р53 при раковых заболеваниях, связанных с ВПЧ (вирусом папилломы человека), таких как рак аногенитальной области, шейки матки, головы и шеи. Во время инфекции HPV экспрессия белка E6 увеличивается, чтобы облегчить репликацию HPV и интеграцию вируса в клетку-хозяин. Белок E6 достигает этого результата за счет использования своего Hect-домена лигазы E3 для связывания и разрушения клеточных белков-супрессоров опухолей p53 и pRB, тем самым устраняя способность клеток-хозяев инициировать остановку клеточного цикла и апоптоз. Терапевтические стратегии, направленные на нарушение взаимодействий E6-p53 в форме антисмысловых приложений и siRNA, специфичных для вирусного белка E6, привлекают наибольшее внимание в терапии рака, связанного с HPV.

Третий широко распостраненный белок, который, как предполагается, является еще одним негативным регулятором активного р53, особенно при прогрессировании рака молочной железы, известен как связывающий ретинобластому белок 6 (RBBP6). RBBP6 представляет собой белок 250 кДа, который обладает активностью лигазы E3. Его мРНК кодирует p53-связывающий домен, а также другие домены, известные как домен DWNN, домен цинкового пальца и домен безымянного пальца, которые ответственны за вездесущую природу RBBP6. RBBP6 является ассоциированным со сплайсингом белком и, следовательно, существует в различных других гомологах, известных как PACT и P2P-R. Нокдаун PACT усиливает взаимодействие p53-Hdm2 (MDM2), тем самым снижая полиубиквитинирование p53 с помощью RBBP6.

Будучи лигазой E3, RBBP6 напрямую взаимодействует с YB-1 через домен RING Finger, что приводит к убиквитинированию и деградации YB-1. Он также регулирует репликацию ДНК и стабильность хромосомных CFs посредством убиквитинирования и протеасомной деградации ZBTB18 (репрессора транскрипции, который играет роль в различных процессах развития, может играть роль в организации хромосом в ядре). RBBP6 может снижать экспрессию белка IκBα, ингибитора пути передачи сигналов NF-κB и активировать тем самым пути передачи сигналов NF-κB посредством убиквитинирования и деградации IκBα, а также дополнительно индуцировать EMT и метастазирование в CRC.

Сверхэкспрессия RBBP6 приводит к остановке клеточного цикла, общей прогрессии туморогенеза, и тесно связана с прогрессированием опухоли при раке шейки матки и пищевода. RBBP6 может играть решающую роль в злокачественном фенотипе рака человека. Трансфекция клеток рака легких siRBBP6 привела к снижению экспрессии RBBP6.

Интересвно, может ли трансфекция siRBBP6 усиливать гибель клеток, индуцированную паклитакселом или камптотецином? Клинические исследования пока не дали на это однозначный ответ и вообще пока почти все вышеупомянутые малые молекулы не дошли до клинического применения.

[albert52]

Вернемся к апоптозу.

Распространенные раковые клетки развили внутреннюю способность противостоять апоптозу, зависящему от закрепления (аноикис). Аноикис вызывается отсутствием клеточной адгезии, процесса, который лежит в основе формирования и поддержания просвета во время развития и гомеостаза молочной железы. В здоровых клетках анойкис в основном регулируется членами семейства белков B-клеточной лимфомы-2 (BCL2). Однако метастатические раковые клетки часто развивают аутокринные BCL2-зависимые механизмы устойчивости для противодействия аноикису.

Пролиферация, дифференцировка и инвазия до начала лактации обеспечивают формирование функциональной разветвленной протоковой сети молочных желез. В то же время их апоптотический потенциал должен подавляться до тех пор, пока не прекратится отлучение от груди и не будет индуцирована инволюция альвеол. Таким образом, регулируемый апоптоз поддерживает баланс между пролиферацией и гибелью клеток в нормальных тканях груди.

Раковый рост ткани молочной железы может иметь место, когда эпителиальные клетки молочной железы не в состоянии производить нормальные уровни про- и антиапоптотических белков, а избыток антиапоптотических факторов приводит к подавлению апоптоза. Впрочем, рак молочной железы с повышенным уровнем апоптоза и пролиферации из-за накопления генетических мутаций и нарушения регуляции экспрессии генов в клетках протоков молочной железы, вероятно, является опухолью высокой степени злокачественности. Так, экспрессия каспазы 3 сильно повышена в 58% DCIS и ~ 90% тканей инвазивного рака молочной железы, но не обнаруживается в нормальных клетках протоков молочной железы. Сильная экспрессия каспаз 3, 6 и 8 достоверно коррелирует с высокой степенью DCIS.

Поскольку высокая скорость апоптоза всегда связана с высоким уровнем пролиферации клеток, повышенная пролиферация активирует передачу сигналов апоптоза в клетках рака груди и вызывает апоптоз в популяциях клеток, которые относительно чувствительны к апоптозу. Это обеспечивает селективное преимущество для роста клеток рака молочной железы, которые разработали устойчивые механизмы для блокирования апоптотического ответа. Так, экспрессия каспазы 3 сильно повышена в 58% DCIS и ~ 90% тканей инвазивного рака молочной железы, но не обнаруживается в нормальных клетках протоков молочной железы,склонных к вызываемому каспазами апоптозу. Сильная экспрессия каспаз 3, 6 и 8 достоверно коррелирует с высокой степенью DCIS.

Проапоптотические белки можно разделить на две группы: многодоменные белки и белки, содержащие только BH3. Существует восемь белков, содержащих только BH3, причем они структурно очень разнообразны и имеют гомологию только в домене BH3. Взятые вместе, белки, содержащие только BH3, работают как сенсоры для множества клеточных стрессов в клетках млекопитающих. При этом каждому типу клеток требуется гомолог BCL2 для регуляции апоптоза; однако специфические проапоптотические белки необходимы для того, чтобы вызывать апоптоз в разных типах клеток и при разных обстоятельствах. Это позволяет клеткам реагировать на многочисленные внутриклеточные сигналы смерти. Например, NOXA и PUMA подвергаются регуляции транскрипции с помощью p53 и активируются при повреждении ДНК, вызванном УФ-излучением (NOXA) и γ-излучением (PUMA).

BIM и BMF являются двумя основными белками, содержащими только BH3, в развитии молочных желез, в основном из-за их ключевой роли в аноикисе и образовании просвета. В ответ на депривацию фактора роста или стресс в эпителиальных клетках молочных желез, BIM и BMF подвергаются прямой транскрипционной активации Fохо3а. Так, при физиологическом отделении эпителиальных клеток глобулоальвеол в них отсутствует устойчивая активность MAPK, позволяющая Fохо3а перемещаться в ядро ​​и транскрибировать BIM, тем самым запуская контролируемую гибель клеток.

Также JAK1-регулируемая активация транскрипционного фактора STAT3 сильно связана с транскрипцией BMF и в меньшей степени с транскрипцией BIM. STAT3-зависимая транскрипция BMF и BIM происходит специфически во время инволюции молочной железы. Ингибирующее действие белков IAP может быть антагонизировано несколькими белками-ингибиторами IAP, такими как Smac / Diablo и XIAP-ассоциированный фактор 1 (XAF1), чтобы вызвать апоптотический ответ.

BIMEL (сверхдлинная изоформа сплайсинга BIM) в закрепленных люминальных клетках, фосфорилированы активным сигнальным каскадом MAPK / ERK и эти клетки не будут подвергаться аноикису. Путь MAPK активируется ниже HER2 и EGFR и при активации этих рецепторов этот путь негативно регулирует апоптоз, частично из-за его ингибирования PTEN. В заякоренных в мембране клетках передача сигналов RTK приводит к активации MAPK, которая фосфорилирует BIMEL и тем самым индуцирует его ubiquitin-опосредованную деградацию и впоследствии ингибирует аноикос. Однако при раке молочной железы отслоившиеся эпителиальные клетки просвета молочной железы также содержат фосфорилированный BIMEL, несмотря на нарушение передачи сигналов RTK из-за отслоения клеток, и поэтому они сопротивляются BIM-опосредованному аноикису. Возникающее в результате наполнение просвета характерно для рака молочной железы in situ.

Белки, содержащие только BH3, являются опухолевыми супрессорами, причем BIM и BMF в молочной железе играют основную роль в подавлении опухолей. В отсутствие любого из этих белков супрессоров протоки молочных желез претерпевают заполнение просвета отслоившимися эпителиальными клетками. Существует терапевтический потенциал малых молекул, похожих на BMF, для восстановления аноики в эпителиальных клетках просвета молочной железы (см. выше).

AKT косвенно подавляет BIM и BMF через фосфорилирование и ингибирование их фактора транскрипции Fохо3а. Соответственно, цитозольная локализация FOXOs связана с плохой выживаемостью у пациентов с раком груди. Наконец, даже после высвобождения цитохрома с AKT может ингибировать апоптоз путем прямого фосфорилирования каспазы-9. Кроме того, AKT способствует выживанию клеток за счет стабилизации IAP.

Избыточная экспрессия BCL2 наблюдается в 85% случаев рака молочной железы ER +, возможно, из-за присутствия двух эстроген-чувствительных элементов в промоторе BCL2, при этом клетки рака груди используют как гормонозависимые (BCL2), так и -независимые средства (через MCL1 ), чтобы обойти BH3-опосредованный апоптоз, поддерживая рост опухоли и способствуя устойчивости к химиотерапии. Кроме того, антиапоптотический белок BCL-XL экспрессируется на низком уровне в нормальных эпителиальных клетках молочной железы, но сильно экспрессируется в 75% тканей карциномы молочной железы.

[albert52]

Рак яичников

Рак яичников - основная причина смерти среди всех гинекологических онкологических заболеваний в западных странах. По сравнению с другими гинекологическими видами рака, уровень смертности от рака яичников превосходит таковой от рака шейки матки и рака эндометрия вместе взятых. Такой высокий уровень смертности объясняется тем, что у большинства пациентов диагноз ставится на поздней стадии, что связано с относительным отсутствием специфических признаков и симптомов заболевания и отсутствием надежных тестов для раннего выявления.

Рак яичников - это высокометастатическое заболевание, характеризующееся широким распространением перитонеальной диссеминации и асцитом, и является основной причиной смерти от гинекологических заболеваний. Несмотря на агрессивное хирургическое вмешательство и химиотерапию на основе платины для пациентов с клинически распростненным раком яичников, общая пятилетняя выживаемость составляет всего 15–20% . Смертность, связанная с заболеванием, при карциноме яичников чаще всего является результатом метастазирования. На момент постановки диагноза в большинстве случаев заболевание распространилось за пределы яичников. Однако при раке яичников I стадии выживаемость может достигать 90%.

Существует более 30 типов и подтипов рака яичников; классифицируются на 3 основные категории в зависимости от первичных клеток, из которых они возникают. Они делятся на следующие категории: эпителиальные опухоли, стромальные опухоли и опухоли половых клеток. Эпителиальные опухоли яичников (карциномы яичников) являются наиболее распространенными и наиболее агрессивными; составляют около 90% всех случаев рака яичников.

К опухолям поверхностного эпителия относится большинство первичных опухолей яичников. Классификация эпителиальных опухолей яичников основана на типе гистологической дифференцировки опухолевых клеток и степени пролиферации эпителия.
Так, в зависимости от дифференцировки опухолевых клеток выделяют 3 основных гистологических типа опухолей: серозные, муцинозные и эндометриоидные. Степень пролиферации эпителия связана с биологическим поведением опухоли: согласно ей опухоли яичников делят на доброкачественные (минимальная пролиферация эпителия), пограничные (умеренная пролиферация эпителия) и злокачественные (выраженная пролиферация эпителия с признаками инвазии в строму).
Около 70% из них являются доброкачественными и пограничными, а 30% — злокачественными. Кроме того, доброкачественные опухоли часто классифицируют в зависимости от составляющих их компонентов на цистаденомы (опухоль представлена кистозными участками), цистаденофибромы (опухоль представлена кистозными и фиброзными участками) и аденофибромы (опухоль представлена преимущественно фиброзными участками). Пограничные и злокачественные опухоли также могут иметь выраженный кистозный компонент, злокачественные опухоли иногда обозначают как цистаденокарциномы. К моменту обнаружения опухоли могут иметь относительно небольшой размер или заполнять собой весь малый таз.

Самая распространенная теория происхождения эпителиальных опухолей яичников — трансформация целомического эпителия. Эта точка зрения основана на особенностях эмбриогенеза яичников, при котором из целомического эпителия образуются мюллеровы протоки, а из них формируется серозный (трубный), эндометриоидный (эндометриальный) и муцинозный (цервикальный) эпителий женских половых органов.
Опухоли этих трех типов эпителия развиваются преимущественно в яичниках, поскольку целомический эпителий часто внедряется в корковое вещество яичника с формированием эпителиальных инклюзионных кист; предполагается, что они являются результатом инвагинаций поверхностного эпителия, который впоследствии теряет связь с поверхностью. Такие кисты чаще всего выстланы мезотелием или трубным эпителием.

Карциномы яичников зависимости от их патогенеза делятся на (1) карциномы на фоне пограничных состояний; (2) карциномы de novo, т.е. без предшествующего поражения. При этом высокодифференцированные серозные, эндометриоидные и муцинозные карциномы часто имеют участки пограничных опухолей того же эпителиального типа, но это сочетание редко наблюдается при умеренно дифференцированных и низкодифференцированных серозных карциномах либо злокачественных смешанных мюллеровских опухолях. Результаты молекулярных исследований также поддерживают эту классификацию.

Гипотеза гонадотропинов предполагает, что повышенные уровни гонадотропинов (ФСГ и ЛГ) играют важную роль в развитии эпителиального рака яичников (EOC). Это подтверждает наблюдение, что ЭОК чаще всего диагностируются у женщин в постменопаузе, при этом средний возраст затронутых женщин составляет более 60 лет, у которых обычно наблюдается высокий уровень гонадотропинов в сыворотке крови. Кроме того, снижение риска EOC связывают с продолжительностью лактации, увеличением числа беременностей (многоплодие) и использованием оральных контрацептивов; при которых типичны либо более низкие уровни гонадотропинов, либо пониженная экспрессия их рецепторов.

Теория непрерывной овуляции предполагает, что частые вызванные овуляцией разрывы OSE без периодов отдыха, вызванных беременностью, являются возможной причиной EOCs. Эта теория предполагает, что повторяющиеся периоды апоптоза и митотического восстановления клеток поверхностного эпителия яичников (OSE) предрасполагают их к генетическим мутациям и геномной нестабильности, которые обычно предвещают начало неопластической трансформации.
Факторы, защищающие от EOC, такие как использование оральных контрацептивов, лактация и беременность, которые характеризуются ановуацией, согласуются с этой теорией. Кроме того, факторы риска, такие как нерожание и использование препаратов, стимулирующих овуляцию (лечение бесплодия), все характерные для непрерывной овуляции, также подтверждают эту теорию.

Отмечена высокая степень окислительного повреждения ДНК на клетках OSE вокруг места овуляции. Предположено, что если повреждение ДНК не восстанавливается, клетка может уклоняться от апоптоза, что приводит к появлению трансформированной клетки-предшественника, которая может размножаться во время митогенной репарации OSE после овуляции. Так, наиболее важным фактором риска, связанным с раком яичников, являются генетические мутации в генах репарации ДНК рака груди BRCA1 и / или BRCA2, которые распространены в семьях с историей рака груди и / или яичников. Мутации BRCA1 предоставляют 30 - 40% шанс заболеть раком, в то время как мутации BRCA2 показывают пожизненный риск 10-15%.

Синдром Линча (также называемый наследственным неполипозным колоректальным раком (HNPCC)) представляет собой мутацию зародышевой линии восстановления несоответствия, которая предрасполагает людей к определенным типам рака, включая рак прямой кишки, эндометрия и яичников. Примерно от 10 до 15% наследственных случаев рака яичников происходит у женщин с синдромом Линча. Более мягкий, менее агрессивный и генетически более стабильный пограничный рак яичников включает мутации KRAS, BRAF, PTEN и ß-catenin.

Около 50% раковых заболеваний человека показали инактивацию p53 в результате мутаций или потери, a в большинстве опухолей, сохраняющих p53 дикого типа, были обнаружены нарушения в p53 пути подавления опухоли. Именно такие опухоли чаще всего характеризуются злокачественным течением.

[albert52]

Продолжим.

Яичник показывает собой парадигму запрограммированной гибели клеток из-за циклической природы развития и функции яичников. Было показано, что апоптоз является основным механизмом гибели клеток в яичниках. Это наблюдалось при потере половых клеток (истощение зародышевых клеток), атрезии фолликулов и регрессии желтого тела (лютеолиз) и поверхностных эпителиальных клетках яичников до овуляции.

Атрезия фолликулов - это разрушение и рассасывание фолликулов яичников, которое происходит до овуляции. Лютеолиз происходит в конце женского репродуктивного цикла при отсутствии беременности. Молекулярные эффекторы, которые являются медиаторами лютеолиза, включают лиганд апоптоза Fas / Fas, простагландин F2α, эндотелины, интегрины и γ-интерферон.

Апоптоз при истощении зародышевых клеток: около семи миллионов ооцитов вырабатываются в яичниках на ранних этапах жизни человеческого плода. Однако вскоре после рождения происходит резкое сокращение количества ооцитов примерно до одной четверти вследствие апоптоза. Дефекты апоптоза или длительная пролиферация половых клеток могут привести к опухолям половых клеток яичника.

Апоптоз и гены, которые его контролируют, оказывают глубокое влияние на злокачественный фенотип. В яичниках Bcl-2 экспрессируется в основном в здоровых фолликулах яичников, в то время как Bax, которая является проапоптотической молекулой, экспрессируется в фолликулах, подвергающихся атрезии. Повышенные гонадотропины имеют тенденцию ингибировать экспрессию Bax, одновременно увеличивая экспрессию Bcl-2 и Bcl-xL, тем самым способствуя выживанию фолликула.

IAP являются эндогенными ингибиторами каспаз, и они могут ингибировать активность каспаз, связывая свои консервативные домены BIR с активными сайтами каспаз, способствуя деградации активных каспаз или удерживание каспаз от их субстратов; XIAP является наиболее мощным ингибитором апоптоза среди всех IAP. Так, выявлена аномальная экспрессия семейства IAP в раковых клетках поджелудочной железы, и эта аномальная экспрессия также является ответственной за их устойчивость к химиотерапии.

В нормальных яичниках повышение уровня ФСГ в яичниках активирует XIAP, что приводит к подавлению апоптоза гранулезных клеток и способствует росту фолликулов, индуцированному ФСГ. При раке некоторые новые методы лечения, направленные на XIAP, включали антисмысловые стратегии и короткие интерферирующие молекулы РНК (миРНК).

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), также известный как кахектин и TNFSF2, является прототипическим лигандом суперсемейства TNF. Это плейотропная молекула, которая играет центральную роль в воспалении, апоптозе и развитии иммунной системы. При нормальном развитии яичников экспрессия некоторых членов семейства TNF, таких как FasL / Fas, сильно зависит от уровней гонадотропинов. Повышение уровня гонадотропина приводит к снижению экспрессии Fas / FasL, что способствует выживанию фолликулов. Однако снижение уровня гонадотропина приводит к повышенной экспрессии Fas / FasL, что приводит к атрезии фолликулов.
TNF-α запускает апоптоз, активируя каспазы; с другой стороны, TNF-α способен способствовать выживанию клеток гранулезы за счет усиления экспрессии XIAP через систему NFκB.

TRAIL - еще один член семейства TNF, который, как было выше показано, индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, но не в нормальных клетках, из-за присутствия рецепторов-ловушек TRAIL, которые конкурентно ингибируют путем связывание лигандов TRAIL с родственными рецепторами.

Интерфероны (IFN): IFN-γ является мощным иммуномодулирующим, противовирусным и антипролиферативным цитокином, обладающим противораковой активностью. Они включают IFN-α, IFN-γ, IFN-β и IFN-δ; IFN-γ непосредственно подавляет рост опухолевых клеток человека. Интерфероны сенсибилизируют клетки к индуцирующим апоптоз генам и белкам в путях апоптоза.
IFN-γ мог бы быть полезным биологическим лечением эпителиального рака яичников человека, если бы устойчивые уровни этого цитокина могли быть достигнуты в брюшине за счет улучшенных стратегий доставки белков или генов.

Интегрины: это рецепторы трансмембранных белков, содержащие α- и β-гетеродимерные цепи и короткий хвост в цитоплазматической области. Они обладают адгезионными свойствами, которые соединяют мембрану с цитоскелетом и способны влиять на выживание и гибель клеток. Они участвуют в пролиферации клеток через пути передачи сигналов, активируя протеинкиназы.

Интегрины экспрессируются на поверхности примордиальных фолликулярных клеток, способствуя их адгезии с внеклеточным матриксом. Интегрины слабо экспрессируются в атретических третичных фолликулах и отсутствуют в атретических первичных и вторичных фолликулах. Клетки гранулезы, у которых отсутствует экспрессия, являются единственными, которые подвергаются апоптозу.

Для лечения рака яичников были исследованы различные целевые терапевтические стратегии, которые часто используются в сочетании с химиотерапевтическими агентами для достижения максимальных результатов. Отметим, что более чем в 70% случаев химиотерапевтического лечения рака яичников наблюдается резистентность к препаратам на основе платины и паклитакселу и последующий рецидив.

Направленные противораковые препараты можно разделить на две широкие категории: ингибиторы киназ и моноклональные антитела. Тирозинкиназы - это молекулы, которые играют решающую роль в передаче сигналов, достигая кульминации своего действия путем регулирования транскрипции генов в ядре. Они функционируют, передавая γ-фосфатные группы от АТФ к гидроксильной группе белковых молекул, ответственных за передачу сигнала. Наиболее важные клеточные процессы, такие как клеточный цикл, дифференцировка, подвижность и апоптоз или выживаемость клеток, находятся под скрупулезной регуляцией тирозинкиназ.

Тирозинкиназы сверхэкспрессируются или мутируют в нескольких типах опухолей у людей, включая опухоли яичников, что делает их хорошими мишенями для лечения рака. Небольшие молекулы были разработаны для нацеливания на тирозинкиназы, в то время как моноклональные антитела нацелены на поверхностные белки или антигены, которые дифференциально экспрессируются, сверхэкспрессируются или мутируют в раковых клетках по сравнению с нормальными тканями.
Моноклональные антитела действуют, вызывая изменения в функции рассматриваемого антигена или рецептора, такие как вызов иммунного ответа или конъюгирование лекарственного средства с антителом, которое нацелено на конкретный антиген.

Так, плохой прогноз при раке яичников связан с повышенной экспрессией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который выполняет такие функции, как ангиогенез, митогенез, повышение проницаемости сосудов и выживаемость эндотелиальных клеток. Низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы при раке яичников нацелены на лиганд и рецептор VEGF , тем самым замедляя ангиогенез и улучшая прогноз заболевания.

Также около 70% случаев рака яичников демонстрируют повышенную экспрессию EGFR, сверхэкспрессия которого коррелирует с химиорезистентностью и плохим прогнозом. Ингибиторы тирозинкиназы, такие как эрлонитиб и гефитиниб, действуют против EGFR, правда при прогрессировании заболевания и рецидивах с низкой эффективностью.

Aurora A - серин-треониновая киназа, которая необходима для многих важных клеточных функций, таких как митоз, формирование веретена и разделение центромер. Сверхэкспрессия Aurora A, а также амплификация местоположения его гена часто отмечались в опухолях человека, в том числе при карциномах яичников. Было показано, что Aurora A ингибирует апоптоз, опосредованный паклитакселом и цисплатином, в раковых клетках яичников. Ингибирование киназы Aurora с помощью небольшой молекулы MK0457 в сочетании с химиотерапией (доцетаксел) показало значительное снижение пролиферации клеток и роста опухоли.

BRCA1 и BRCA2 играют важную роль в восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК и поддержании стабильности генома. Мутации в этих генах составляют от 5 до 10% всех случаев рака яичников, причем более чем в 50% случаев серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности наблюдается потеря функции генов BRCA по генетическим или эпигенетическим причинам.

Поли-АДФ-рибозная полимераза (PARP) представляет собой ядерный фермент, участвующий в репарации одноцепочечных разрывов ДНК. Он активируется при повреждении ДНК, и его ингибирование приводит к одноцепочечным разрывам ДНК, что в свою очередь может привести к двухцепочечным разрывам. Пациенты с BRCA1 и BRCA 2 проявляют высокую чувствительность к ингибиторам PARP, например к олапариб (создан небезызвестной AstraZeneca). Однако он одобрен только для пациенток с мутацией BRCA (это та самая мутация, из-за которой Анджелина Джоли приняла решение удалить себе молочные железы и яичники). Дело в том, что он работает лучше у BRCA-мутантных больных, и когда BRCA он не работает, клетка вынуждена пользоваться обходными путями, такими как PARP.

Препарат niraparib показал преимущество по безрецидивному выживанию не только у пациенток с мутацией BRCA, но и без неё. У пациенток с мутацией препарат увеличил медиану времени выживаемости без прогрессирования с 5,5 до 21 месяца по сравнению с плацебо, а у пациенток без мутации — с 3,9 до 9,3 месяцев.

От 50% до 80% случаев рака яичников демонстрируют активацию рецептора PDGF (фактора роста тромбоцитов) в результате мутаций, генетической амплификации или хромосомных перестроек. Значительная индукция апоптоза и уменьшение веса опухоли, когда мезилат иматиниба (STI571), нацеливаный на рецептор PDGF, использовался в комбинации с паклитакселом. Однако сам по себе STI571 не вызвал каких-либо значительных эффектов.

[albert52]

Продолжим.

Карциномы яичников неоднородны и в основном классифицируются по типу клеток на серозные, муцинозные, эндометриоидные, светлоклеточные и Бреннеровские (переходные) опухоли, соответствующие различным типам эпителия в органах женского репродуктивного тракта.

В современной модели опухоли яичников делятся на две группы, обозначенные как тип I и тип II. Серозная карцинома низкой степени злокачественности (MPSC) представляет собой прототипную опухоль типа I и развивается поэтапно от атипичной пролиферативной опухоли через неинвазивную стадию MPSC (обе эти опухоли квалифицируются как пограничные), прежде чем стать инвазивной.
Поскольку серозные пограничные опухоли (SBT) редко связаны с инвазивной серозной карциномой, они представляют собой отдельную сущность, не связанную с инвазивной карциномой. Тем не менее, SBT иногда прогрессируют до карциномы, и поэтому должна существовать некоторая взаимосвязь. Напротив, муцинозные пограничные опухоли (МВТ) часто связаны с инвазивной муцинозной карциномой.

Серозная карцинома высокой степени злокачественности представляет собой прототипную опухоль типа II и развивается из поверхностного эпителия яичников или кист включения без морфологически распознаваемых промежуточных стадий. KRAS и BRAF мутации в этих новообразованиях, в отличие от ТР53, обнаруживаются редко. Они очень агрессивны и быстро распространяются, учитывая их продвинутую стадию на момент обращения.

В опухолях I типа гистологические переходы от аденофибром и атипичных пролиферативных серозных опухолей (APST) к неинвазивным MPSC наблюдаются почти в 75% случаев. Кроме того, в значительной части случаев обнаруживаются области инфильтративного роста (инвазии стромы), непосредственно прилегающие к неинвазивному компоненту. Гистологически характеризуется небольшими плотными гнездами и микропапиллами, беспорядочно инфильтрирующими строму. Эти инвазивные MPSC являются синонимом серозной карциномы низкой степени злокачественности.

APST и неинвазивный MPSC можно рассматривать как аналог дисплазии и карциномы in situ шейки матки. То есть APST - это доброкачественная пролиферативная опухоль, которая может прогрессировать до неинвазивного MPSC, который является непосредственным предшественником инвазивной микропапиллярной серозной карциномы низкой степени злокачественности.

Серозная карцинома низкой степени злокачественности обычно протекает безболезненно и может длиться более 20 лет. Приблизительно от 50 до 60% пациентов в конечном итоге умирают из-за широко распространенного внутрибрюшного карциноматоза, но опухоль сохраняет свой гистологический тип и низкий индекс пролиферации на протяжении всего процесса. Такие опухоли с небольшими очагами, демонстрирующими микропапиллярную архитектуру, обозначают как «микрокарциному.

Цитологически инвазивный MPSC состоит из относительно однородной популяции клеток с небольшими округлыми ядрами, часто содержащими небольшое, но заметное ядрышко; многоядерность практически отсутствует. Такие карциномы составляют примерно 10% всех серозных карцином. По шкале от 1 до 3 эта степень ядерной атипии квалифицируется как степень 1.

Мутации KRAS и BRAF по-видимому, возникают на очень ранней стадии развития MPSC низкой степени злокачественности, о чем свидетельствует демонстрация того, что те же мутации KRAS и BRAF, обнаруженные в SBT, обнаруживаются в эпителии цистаденомы, соседнем с SBT. Мутации в TP53 очень редки.

Онкогенные мутации в BRAF, KRAS и ERBB2 приводят к конститутивной активации пути пере -дачи сигнала митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), причем KRAS мутации в кодонах 12 и 13 встречаются в одной трети инвазивных низкосортных MPSC и еще в одной трети SBT. Точно так же мутации BRAF в кодоне 600 встречаются в 30% серозных карцином низкой степени злокачественности и в 28% случаев SBT. Мутации в KRAS, BRAF и ERBB2 исключают друг друга (как в колоректальном раке), а прогрессирование APST до MPSC имитирует последовательность аденома-карцинома.

Напротив, опухоли типа II с самого начала агрессивны и высокой степени злокачественности, и, поскольку предшествующие поражения не были идентифицированы, считается, что они возникают de novo. В эту группу входят серозная карцинома высокой степени злокачественности, смешанные злокачественные мезодермальные опухоли (MMMT) и недифференцированные карциномы.

Поскольку многие из этих опухолей имеют микропапиллярную архитектуру, можно предположить, что они возникли из подгруппы серозных карцином низкой степени злокачественности, в которых отсутствовали мутации KRAS, BRAF и ERBB2 . Последующее приобретение TP53 мутация могла привести к генетической нестабильности, которая, в свою очередь, способствовала повышению уровня ядерной атипии (степень 2), вплоть до сильно плеоморфных, часто многоядерных клеток (степень 3).

Значительное количество «карцином яичников» типа II развивается за пределами яичника, в частности, брюшины и маточной трубы, и вторично поражает яичник. Эндометриоидная карцинома и светлоклеточная карцинома связаны с эндометриозом яичников или таза в 15–50% случаев, ведущие исследователи предполагают, что эндометриоз является предшественником этих опухолей. В редких случаях серозная карцинома высокой степени ассоциируется с эндометриозом яичников.

Около 50% карцином яичников развиваются из уже существующих кистозных поражений, соответствуя I типу, остальные 50% развиваются в яичниках без видимых отклонений на УЗИ. Они состоят из больших масс клеток, которые часто имеют сосочковую архитектуру. Некроз - обычное явление. Опухолевые клетки имеют большие плеоморфные ядра, многие из которых многоядерные. Наблюдается высокий уровень митотической активности и часты аномальные митотические числа.

Серозные карциномы высокой степени злокачественности и аденокарциномы MMMT имеют сходные молекулярно-генетические профили. В будущем может оказаться более целесообразным включить все эти плохо дифференцированные / недифференцированные карциномы в единую категорию «анапластической карциномы».

Муцинозные опухоли (MBT) имеют некоторое сходство с серозными опухолями; 80% МВТ на поздних стадиях связаны с псевдомиксомой брюшины (PMP). Метастатические муцинозные карциномы из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, включая желчевыводящие пути, поджелудочную железу и шейку матки, могут метастазировать в яичник и имитировать первичную муцинозную опухоль яичников. Первичная MBT, в отличие от SBT, никогда не распространяются за пределы яичника.
Наиболее частым молекулярно-генетическим изменением МВТ и муцинозных карцином является точечная мутация KRAS. Возрастающая частота мутаций KRAS в кодонах 12 и 13 была описана в цистаденомах, MBT и муцинозных карциномах соответственно.

Светлоклеточная карцинома яичников ((OCCC) составляет от 10% до 15% всех случаев рака яичников. OCCC считается одним из наиболее агрессивных видов рака, поскольку он, как правило, невосприимчив к традиционным химиотерапевтическим препаратам, таким как таксол или цисплатин.
OCCC связан с повышенной экспрессией провоспалительных цитокинов, поэтому ингибирование интерлейкина-6 (IL-6) снижает пролиферацию клеток OCCC. Фактор транскрипции ядерного фактора RelA κB (NF-κB) является основным фактором, управляющим индукцией цитокинов. А цитокины участвуют во взаимодействии рака и стромы, которое может управлять процессами, вовлеченными в прогрессирование рака, такими как ангиогенез (например, IL-8) и метастазы (например, CXCL1). Отсюда ингибирование NF-κB может принести пользу лечению OCCC, блокируя прогрессирование рака.

Компоненты комплекса SWI / SNF, включая ARID1A, часто мутируют при различных типах рака. Так, ARID1A часто мутирует при OCCC и часто сосуществует с активирующими мутациями PIK3CA, который действует через путь AKT-IKK2, высвобождая RelA (путь NF-κB) из ингибитора каппа B (IκB). Мутация PIK3CA освобождает RelA от IκB, так что RelA может проникать в ядро ​​для активации генов цитокинов. Также рекрутирование репрессорного комплекса Sin3A/гистон -деацетилазы (HDAC) на гены цитокинов нарушается из-за потери ARID1A, что приводит к их дерепрессии.

Ингибитор NF-κB частично снижает пролиферацию OCCC и улучшает эффективность карбоплатина (производное цисплатина). При этом ингибирование NF-κB может избирательно подавлять рост мутантных клеток ARID1A / PIK3CA, не затрагивая при этом нормальные клетки или OCCC без этих мутаций.

[albert52]

Вставка

Большинство внутриклеточных белков разлагается посредством UPS, который состоит из двух этапов: убиквитинирования целевого белка и деградации протеасомой. Убиквитин-лигазы специфически распознают целевые белки и катализируют убиквитинирование, тем самым контролируя специфичность протеолиза, опосредованного UPS. Убиквитинирование само по себе представляет собой посттрансляционную модификацию белков. Сравнительные модификации представляют собой связывание убиквитин-подобных белков, таких как SUMO , Urm1 или Nedd8, соответствующих сумоилированию, Urmylierung или неддилированию.

Убиквитин - это небольшой белок; процесс маркировки белков-мишеней убиквитином называется убиквитинилированием. Несколько убиквитинов, прикрепленных в цепь, маркируют белок, таким образом полиубиквитинируемый при контроле качества белка, предназначая на деградацию в протеасоме. Само по себе убиквитинирование является многофазным процессом, три основных этапа которого катализируются различными ферментами: убиквитин-активирующий (E1), убиквитин-конъюгированный (E2) и, наконец, убиквитинлигазы (E3), которые по-разному связывают убиквитин с определенными белками-субстратами.

Ub-конъюгирующие ферменты (E2) UBE2C и UBE2S взаимодействуют с (APC / C (комплексом / циклосомой, стимулирующим анафазу Ub-лигазы E3) для регулирования клеточного цикла при раке. Повышение уровня UBE2C наблюдается при раке легких, мочевого пузыря и яичников. Фермент E2 UBE2B увеличивает полиубиквитинирование β-катенина, белка, который часто активируется в раковых клетках. Кроме того, UBE2B кооперируется с MDM2, лигазой E3 Ub, в комплексе, способствующем убиквитинированию и деградации супрессора опухоли p53.

Разнообразие целевых белков, модифицированных убиквитином, отражается в количестве различных ферментов E3. Если принять во внимание все ферменты, структурно принадлежащие к трем подсемействам ферментов E3 (HECT, RING и U-Box), для высших организмов можно принять число от нескольких сотен до одной тысячи. Здесь Е3 лигазы либо ведут себя как истинные ферменты (HECT E3s), либо занимаюися «сватовством» (RING E3s).
Так, RING finger E3 ubiquitin ligase RNF146 (также известная как Iduna) отвечает за PARylation-зависимое убиквитинирование AXIN, тем самым положительно регулируя передачу сигналов Wnt. Здесь PAR (поли (АДФ-рибоза) функционирует как «молекулярный переключатель» для изменения аллостерической конформации RNF146 и активации его лигазной активности для убиквитинирования и деградации целевых белков.

С другой стороны, существует ряд различных десубиквитинирующих ферментов (DUB), под действием которых, помимо прочего, присоединенные молекулы убиквитина могут быть снова удалены. DUB представляют собой протеазы, состоящие из пяти подсемейств, включая убиквитинкар -боксиконцевые гидролазы (UCH), убиквитинспецифические протеазы (USP), опухолевые протеазы яичников (OTU), металлопротеазы JAMM / MPN и протеазы болезни Мачадо-Якоба (MJD). Все DUB представляют собой цистеиновые протеазы, кроме металлопротеаз JAMM / MPN 6 .

Убиквитин имеет глобулярную форму, выступают только последние четыре С- концевые аминокислоты. Важными функциональными аминокислотами являются C- концевой глицин (G) в 76-м положении (G76) и лизины (K) в 48-м (K48) и 63-м положении (K63) аминокислот -ной последовательности. Через C- концевую карбоксильную группу на G76 убиквитин ковалентно связывается со специфическими лизинами, цистеинами, серинами, треонинами или N- концом маркируемого белка . Дополнительные молекулы убиквитина могут быть присоединены к уже связанному убиквитину через лизины, так что образуется цепь убиквитина. Поскольку убиквитин содержит всего семь лизинов, возможны по крайней мере семь различных типов соединения убиквитина.

Если по крайней мере пять молекул убиквитина связаны в цепь с целевым белком, это называется полиубиквитинизацией. Если эти молекулы связаны друг с другом по лизину 48 (K48), целевой белок в основном расщепляется протеасомой . Соединение по лизину 63 (K63) может привести к лизосомной деградации белка или активировать киназы.Здесь K63 и линейные цепи убиквитина играют роль каркаса для сигнальных сборок и играют важную роль во многих биологических процессах, включая воспаление.

С другой стороны, моно- и мультиубиквитинации меньше влияют на стабильность отдельных белков, чем на их внутриклеточное распределение, и могут обеспечивать взаимодействие с другими белками. Олигоубиквитинирование, например, влияет на активность фактора транскрипции, не инициируя его деградацию. Моноубиквитинирование играет преобладающую роль в транспортировке белков, в то время как полиубиквитинирование способствует транспортировке белков (через K63) и деградации (через K48).

Система убиквитиновых протеасом играет важную роль в «обеспечении качества» внутриклеточно продуцируемых белков. Белки должны быть правильно сложены во время и после их производства, чтобы они функционировали. Особые белки - шапероны могут способствовать правильному сворачиванию белка. В случае «непоправимого» неправильного свертывания образуется комплекс белок-шаперон-убиквитин-E3-лигаза, который полиубиквитинирует неправильно свернутый белок и, таким образом, делает возможной деградацию протеасомой. Таким образом гарантируется, что структурно вырожденные белки ни цитозольные, ни мембранно- связанные, не влияют на клеточные процессы.

Убиквитин участвует во внутриклеточной передаче сигнала внешних стимулов, например, в сигнальном пути NF-kB ( англ. Nuclear factor kappa B). Он может быть активирован сигнальной молекулой фактора некроза опухоли (TNF). Если TNF связывается с рецептором TNF клеточной мембраны, E3-лигаза TRAF2 рекрутируется во внутриклеточную часть рецептора путем его конформационного изменения . Она полиубиквитинирует себя и белок RIP через связи K63.
Убиквитинированные белки RIP и TRAF2 продуцируют разные киназы, фосфорилирующие ферменты. Киназа βIκ в конечном итоге фосфорилирует белок IκB, что освобождает ранее связанный и неактивный NF-κB. NF-κB мигрирует в ядро клетки и активирует там транскрипцию определенных генов. IkB, с другой стороны, полиубиквитинируется через K48 и разлагается через протеасомы.

Ингибиторы протеасом были первоначально разработаны для лечения кахексии, которая возникает у пациентов с запущенными формами рака и характеризуется катаболическим состоянием, которое приводит к прогрессирующему истощению. В настоящее время существует два ингибитора протеасом, одобренных FDA, бортезомиб (Velcade), пептид боронат, и карфилзомиб (Kyprolis), пептид-эпоксикетон.

Лечение бортезомибом приводит к стабилизации I-κB, важного супрессора передачи сигналов NF-κB. Кроме того, бортезомиб также вызывает накопление двух важных негативных регуляторов клеточного цикла, p27 KIP1 и p53, оба из которых являются важными супрессорами опухолей. Другим потенциальным преимуществом лечения бортезомибом может быть накопление проапоптотического белка BAX, тем самым смещая баланс в сторону апоптоза. И последнее, но не менее важное: бортезомиб также вызывает стресс эндоплазматического ретикулума и окислительный стресс в раковых клетках, что может ускорить апоптоз.

Карфилзомиб блокирует доступ субстратных белков к каталитическим остаткам. Карфилзомиб необратимо подавляет протеасомную активность до уровня менее 20%, поэтому единственный способ восстановить протеасомную активность - это заново синтезированные и собранные протеасомы. Следовательно, карфилзомиб более эффективен, чем бортезо -миб, вызывая ответы, например, при устойчивой к бортезомибу множественной миеломе.

При раке груди широко используются антагонисты ER, прежде всего тамоксифен, вместе с ингмбмторами ароматазы. Но в конечном итоге сопротивление эндокринной терапии почти неизбежно. Секвенирование рецепторов показало , что точечные мутации в ESR1 являются драйверами для устойчивости к существующим терапии.
Кроме того, антагонисты ER могут обладать агонистическими свойствами в определенных тканях, таких как матка, что затрудняет их использование. Поэтому неудивительно, что существует значительный интерес к разработке селективных подавляющих регуляторов ER (SERDs) для нацеливания на ER для деградации. В настоящее время фулвестрант, антиэстроген с чистой антагонистической активностью, является единственной молекулой SERD, одобренной для лечения рака груди. Однако плохие фармацевтические свойства этого инъекционного препарата и отсутствие его превосходства над ингибиторами ароматазы второй линии при поздней стадии рака груди отрицательно повлияли на его клиническое применение.

Элацестрант - это новый нестероидный пероральный биодоступный селективный деструктор эстрогеновых рецепторов (SERD), который продемонстрировал активность у пациентов с эстроген-положительным / HER2-отрицательным раком груди, ранее получавшим эндокринную терапию, включая фулвестрант и / или CDK 4/6 ингибитор терапии, а также у больных с ESR1 мутаций ( ESR1-mut), что, как известно, придает эндокринную резистентность.

Базедоксифен (BZA) - мощный пероральный антиэстроген, который клинически одобрен для использования в заместительной гормональной терапии (DUAVEE). Он показал сильные антагонистические профили и профили SERD в груди, сохраняя при этом полезные агонистические свойства в кости и не стимулировал ткань эндометрия в доклинических исследованиях.

[albert52]

Продолжим.

Помимо убиквитина, у млекопитающих существует более дюжины убиквитин-подобных молекул (Ubls), которые все активируются эквивалентным ферментативным каскадом для конъюгации со своими родственными субстратами. Один из этих путей конъюгации с Ubl включает NEDD8, молекулу Ubl, которая имеет примерно 60% сходства последовательностей с убиквитином. Как и убиквитинирование, неддилированные субстраты, в частности кулины - регуляторный каркас мультисубъединичных E3-лигаз - играют критическую роль в пролиферации клеток.

Подобно убиквитинированию, конъюгация зрелого NEDD8 с белками-мишенями осуществляется мультиферментным каскадом E1-E2-E3. Зрелый NEDD8 конъюгируется с белками-мишенями АТФ-зависимым образом посредством последовательных реакций, катализируемых последовательно E1 (NAE), E2 (Ubc12) и E3. С помощью этих ферментов C-концевой глицин NEDD8 образует изопептидную связь с лизином целевого белка. Денеддилазы, такие как CSN и NEDP1, деконъюгируют NEDD8 из недилированных белков перед протеосо -мой, захватывающей высвобождающийся субстрат.

NAE - единственный специализированный NEDD8 E1, но помимо NAE, фермент, активирующий убиквитин E1, UBE1 также может функционировать как атипичный NEDD8 E1, опосредуя присоединение NEDD8 к цепи убиквитина. Другие убиквитин-лигазы, такие как MDM2, c-Cbl, паркин и IAP, также могут функционировать как лигазы E3 NEDD8, способствуя неддилированию различных клеточных белков.

Основными известными субстратами модификации NEDD8 являются Cullin - субъединицы убиквитинлигаз E3 на основе Cullin, которые активны только при неддилировании. Их NEDDylation является критическим для рекрутирования E2 в лигазный комплекс, тем самым облегчая конъюгацию убиквитина, то есть NEDD8 является модулятором процесса убиквитинирования. Путь NEDD8, по-видимому, влияет на функцию UPS, по крайней мере, посредством регулирования активности убиквитинлигазы, антагонизма убиквитинированию или контроля удлинения убиквитиновой цепи.

Неддилирование регулирует активность CRL, самого большого известного класса убиквитинлигаз. CRL состоит из каркасного белка cullin, белка RING Rbx1, который рекрутирует убиквитин E2, адаптивного белка Skp1, который взаимодействует с белком F-бокса, и самого F-бокса, распознающего субстрат. Сочетая индивидуальный кулин (всего их 7 видов) с различными белками F-бокса, CRL контролируют деградацию огромного количества клеточных белков и, что неудивительно, участвуют во многих аспектах биологических процессов.

CRLs составляют ~ 20% всей протеасомной деградации в клетке, а многие CRL-белки связаны с опухолевым генезом. Так, при апоптозе комплекс, образующийся после активации рецепторов смерти TRAIL-R1 / R2 (DR4 / DR5), называется сигнальным комплексом, индуцирующим смерть (DISC), состоящим из рецепторов, адапторной молекулы FADD, прокаспазы-8 и FLIP. FADD рекрутирует прокаспазу-8 в этот комплекс, где она образует гетеродимер с длинной формой FLIP (L)), регулирующей ее процессинг и активность .

Cullin-3 взаимодействуя с TRAIL-R2 DISC, способствует K63-связанному убиквитинированию p10-субъединицы каспазы-8, что усиливает ее ферментативную активность и индукцию апоптоза. Связь p43-FLIP (L) с TRAIL-R2 DISC усиливает его взаимодействие с SCF Skp2 (см. ниже), что приводит к нацеливанию p43-FLIP (L) на протеасомы и снижение уровней гетеродимера FLIP (L): каспаза-8. Так возникает конкуренции между SCF Skp2 и каноничес -кимии белками DISC за связывание p43-FLIP (L). Таким образом Cullin-1 регулирует DISC главным образом посредством модуляции FLIP (L).

Недилирование кулинов запускает сборку функциональных CRL, приближает заряженный убиквитином E2 и субстрат и способствует переносу убиквитина к субстратам. После завершения убиквитинирования CSN делает возможным денеддилирование кулинов, что приводит к разборке CRL и высвобождению убиквитина E2 для следующего раунда убиквитинирования.

Такие Е3 лигазы, как Mdm2, Рarkin и Smurf1, также могут быть модифицированы с помощью NEDD8, и такая модификация влияет на их убиквитинлигазную активность. Например, Smurf1 представляет собой убиквитинлигазу HECT, неддилирование которого усиливает его ассоциацию с убиквитин E2, что играет решающую роль во многих процессах, включая развитие клеточного цикла, пролиферацию клеток, дифференцировку, поддержание стабильности генома и метастазирование. Так, при колоректальном раке человека повышенная экспрессия Smurf1, NEDD8, NAE1 и Ubc12 коррелирует с прогрессированием рака.

Показано также, что неддилирование ряда клеточных белков, таких как PINK1, HuR и RCAN1, противодействует убиквитинированию и увеличивает их стабильность. Например, HuR представляет собой РНК-связывающий белок, который регулирует пролиферацию и выживаемость клеток. HuR модифицируется NEDD8 по его лизинам 283, 313 и 326, что опосредуется NEDD8 E3 лигазой Mdm2. Неддилирование HuR подавляет его убиквитинирование, увеличивает его стабильность и способствует его ядерной локализации.

Также возможно, что при (протеотоксическом) стрессе, NEDD8 функционирует как заменитель убиквитина и блокирует убиквитиновую цепь, таким образом предотвращая чрезмерное удлинение убиквитиновой цепи и истощение пула убиквитина, что в противном случае было бы катастрофично для клеток.

Активированный NEDD8 необходим в двух путях репарации ДНК: NER и NHEJ, при этом накопление NEDD8 в сайтах повреждения ДНК является очень динамичным процессом. Неддилирование необходимо в течение короткого периода суб-пути глобальной репарации генома (GGR) - эксцизионной репарации ДНК (NER). В GGR NER после того, как повреждение ДНК вызвано УФ-облучением, Cul4A в комплексе белка 2 связывания повреждений ДНК ( DDB2 ) активируется NEDD8, и это позволяет GGR-NER приступить к устранению поврежде -ния.

Неддилирование также играет роль в восстановлении двухцепочечных разрывов. Негомологичное соединение концов (NHEJ) - это путь репарации ДНК, часто используемый для репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Первый шаг на этом пути зависит от гетероди -мера Ku70 / Ku80, который образует высокостабильную кольцевую структуру, охватыва -ющую концы ДНК. Но гетеродимер Ku должен быть удален, когда NHEJ завершается, иначе он блокирует транскрипцию или репликацию. Он убиквитилируется, чтобы способствовать высвобождению Ku и других факторов NHEJ из сайта репарации после завершения процесса.

Если активация NEDD8 ингибируется, клетки с индуцированным дефицитом NER или NHEJ могут погибнуть из-за недостаточной репарации ДНК, приводящей к накоплению повреж -дений ДНК. Эффект ингибирования NEDD8 может быть больше для раковых клеток, чем для нормальных клеток, так как они более активны в альтернативных путях репарации ДНК (см.выше). Ингибитор NAE, MLN4924 (певонедистат) индуцирует гибель клеток из-за неконтролируемого синтеза ДНК во время S-фазы клеточного цикла, приводя к повреждению ДНК и индукции апоптоза. MLN4924 взаимодействует с сайтом связывания нуклеотидов в NAE и образует ковалентный аддукт, который имитирует NEDD8-AMP, но не может участвовать в последующих реакциях, что приводит к блокированию функции NAE.

F-box белок SKP2 образует комплекс с CUL1, SKP1 и белком RING-пальца RBX1, вместе называемый SCF SKP2. SKP2 был впервые идентифицирован как критический регулятор клеточного цикла, потому что он убиквитинирует несколько важных регуляторов клеточного цикла, включая p27 KIP1 и p21 CIP1 , оба являются критическими ингибиторами CDK. SKP2 также играет критическую роль в EGFR-обеспечиваемом убиквитинировании AKT и рекрутировании мембран. Онкогенный потенциал SKP2 был предложен его избыточной экспрессией в различном злокачественных опухолях человека. Важно отметить, что эта сверхэкспрессия SKP2 показала обратную связь с p27 KIP1. Более того, уровни белка SKP2 могут служить прогностическим биомаркером, с более высокими уровнями, предсказывающими плохую выживаемость пациентов.

Cинтетический сompaund 25 нарушает взаимодействие между SKP1-SKP2 и, таким образом, отменяет активность лигазы SCF SKP2 . Он синергетически взаимодействуя с химиотерапевтическими агентами снижает выживаемость опухоли.

Мультидоменный связывающий белок 6 ретинобластомы (RBBP6) принадлежит к особому семейству эукариот и отсутствует у прокариот. Молекулярные функции RBBP6 включают метаболизм нуклеиновых кислот (репликацию, транскрипцию и сплайсинг пре-мРНК), активность убиквитинлигазы E3 и взаимодействие с p53 и белком ретинобластомы (RB1).

Белок контрольной точки сборки митотического веретена (MAD2L2) взаимодействует с RBBP6; он контролирует контрольную точку митоза. Он действует в комплексе с другими белками, чтобы напрямую ингибировать Cdc20, не позволяя ему активировать комплекс, способствующий анафазе (APC), убиквитинлигазу, которая важна для инициации сегрегации хромосом. Это означает, что RBBP6 действует на решающем этапе, когда сегрегация хромосом происходит в митозе и в мейозе. В противном случае может возникнуть анеуплоидия.

RBBP6 также обнаруживается в областях прикрепления ядерного матрикса (MAR), что указывает на участие в организации хроматина, где он рекрутирует p53 и Rb, а также член серин-аргининового подсемейства протеинкиназ, известных как SRPK1a, и факторы прикрепления матрикса, SAF-B и нуклеолин. Эти особенности дополнительно усиливают роль RBBP6 в организации хроматина.

RBBP6 экспрессируется на ранних стадиях развития человека и идентифицируется как «тот, кто рано встает»: он легко обнаруживается в ооците и сильно активируется на стадиях 2-8 клеток. RBBP6 также является одним из белков с более чем трехкратной экспрессией в плюрипотентной РНК эмбриональных стволовых клеток человека.