Очерк натуральной онкологии

[albert52]

Диффузный рак желудка

Этиология DGC разнообразна. В то время как кишечная метаплазия хронической инфекционной этиологии (например, H. pylori) чаще связана с IGC, чем с DGC, вирус Эпштейна-Барра (EBV), по-видимому, связан с DGC, хотя сила этой связи не так высока. Употр***ение табака также, по-видимому, связано с развитием DGC.

Опухолевые клетки при DGC укрываются внутри богатой фиброзной стромы, которая простирается в подслизистые слои и возникает на фоне нормальной слизистой оболочки. Это контрастирует с IGC, который обычно проявляется как клетки, расположенные в трубчатых или железистых структурах, которые возвышаются над поверхностью слизистой оболочки и возникают на метапластическом фоне (см. выше).

Общие гены CNA-EMT между DGC и IGC включают GLI2, который связан с пролиферацией; EP300 с множественными функциями ингибитора противоопухолевого иммунного ответа посредством метаболической модуляции; PTPN11, связанный с прогрессированием РЖ; и NDRG1, связанные с метастазированием и плохим прогнозом при РЖ .
Гены EMT, связанные с IGC, включают MICAL2, MYC и PIK3R1. MICAL2, дестабилизирующий F-актин в динамике цитоскелета, был связан с плохим прогнозом при GC. PIK3R1 участвует в сигнальном пути PI3K/AKT, играя роль в апоптозе и выживании клеток, а также в резистентности к химиотерапии при GC.

На ранней стадии DGC мутантные клетки отслаиваются от желудочного эпителия и образуют небольшие поражения в слизистой оболочке (pT1a). Эти внутрислизистые поражения содержат диффузно распространенные перстневидные клетки (SRC) - см. выше. Кроме того, обычно присутствует небольшая фракция морфологически менее дифференцированных клеток, у которых отсутствует накопление муцина; со временем их количество увеличивается.
Более того, многие желудочные маркеры (ANXA10, VSIG1, CLDN18, CTSE, TFF2, MUC5AC и MUC6) и характерные для функций желудка, включая пищеварение, всасывание, секрецию и образование желудочного сока белки , такие как PGC, GIF, GAST и ATP4A, как было обнаружено, теряются в опухолях (повреждение и убыль генов надстройки). Потеря идентичности ткани желудка является важным общим признаком DGC.

В целом протеом опухоли был значительно обогащен белками эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), клеточного цикла, репликации ДНК, контрольных точек, передачи сигналов p53 и путями воспалительной реакции, тогда как протеом близлежащей ткани был обогащен путями метаболизма, такими как метаболизм жирных кислот, окислительное фосфорилирование и метаболизм аминокислот (как я уже упоминал, опухолевые клетки подбирают себе или воспитывают соседей).
Так, ассоциированные с раком фибробласты (CAF) представляют собой основной компонент микроокружения поражений DGC и участвуют в прогрессировании и инвазии опухоли. CAFs очень распространены в опухолях DGC по сравнению с раком желудка кишечного типа, особенно в инвазивных областях опухолей. Опухолевые клетки могут привлекать предшественники CAF и стимулировать их переход к протуморозным CAF частично за счет секреции TGF-β. Кроме того, многие стромальные клетки, включая CAF и иммунные клетки, участвуют в формировании иммунорепрессивной среды в DGC, что может способствовать прогрессированию опухоли.

Отметим, что SRC являются дифференцированными гипопролиферативными клетками и, следовательно, вряд ли будут непосредственно способствовать возможной злокачественности DGC. Внутренняя дифференцировка отслоившихся клеток будет ограничивать рост поражений внутри слизистой оболочки и потенциально может также привести с течением времени к их исчезновению. Так, у пациентов с HDGC несмотря на наличие многих ранних поражений, в течение лет или десятилетий обычно развивается только одна распространенная опухоль, которая больше по размеру и проникает в подслизистую оболочку и более глубокие слои тканей (≥pT2).

В рамках Атласа генома рака (TCGA) DGC были преимущественно обнаружены в подгруппе GS (до 73%), хотя DGC также были замечены в небольшом количестве во всех других подгруппах. В соответствии с известной эпидемиологией DGC, подгруппа GS, как правило, диагностируется в более молодом возрасте.
В рамках исследования TCGA кластер GS также имел высокую частоту соматических мутаций CDH1 (37% случаев), мутаций RHOA (15% случаев) и слияния CLDN18 - ARHGAP (15% случаев). RHOA и CLDN18 - ARHGAP мутации являются взаимоисключающими. Когорта GS была связана с отсутствием значительной пользы от адъювантной терапии (HR для рецидива после химиотерапии = 0,83) и в целом худшим прогнозом.

Что касается протеомной классификации, то DGC можно отнести к подтипам клеточного цикла (PX1), EMT (PX2) и подтипу обогащения иммунологического процесса (PX3) только на основании их измененных паттернов протеома. Также PX1 имеет наименьшее количество мутаций ДНК, а PX3 - наибольшее; мутации ДНК в PX3 показали обогащение в нескольких путях, включая CXCR4, PI3K-AKT и пути фокальной адгезии.
Другие предлагаемые системы классификации больше ориентированы на клинико-патологические характеристики, в том числе предложенная Shah et al., которые разделили GC на три клинических подтипа - проксимальный недиффузный, дистальный недиффузный и диффузный - и обнаружили различные профили экспрессии генов для каждой подгруппы.

В исследовании из 87 мутировавших генов с укороченной мутацией только 4 гена ( RBMX , ARID1A , SOX9 и TMPO ) демонстрировали значительно более низкую экспрессию белка при рассмотрении только усеченных мутаций, предполагая, что очень немногие мутации сильно влияют на экспрессию белка. Из 9 генов, экспрессия которых в эксперименте была в целом изменена, продукты мутантного гена-супрессора опухоли (TSG) (ARID1A, ATM, BAX, PLEKHA6, SOX9) демонстрировали пониженную экспрессию, тогда как продукт онкогена MED12 демонстрировал повышенную экспрессию.

Мутации в TAF1 и KMT2C наблюдались исключительно в DGC, чаще наблюдались у тех, у кого была гистология перстневых клеток, с усеченными или вредными мутациями TAF1, обычно встречающимися вместе с мутациями CDH1 или TP53. Образцы DGC также имели более высокую плоидность, чем рак кишечного типа, с частой гетерозиготной делецией хромосомы 3p, области, охватывающей несколько генов-супрессоров опухоли, 9p24 с участием JAK2 и CD274(PD-L1) и дупликация 20q, которая включает несколько онкогенов.

Опухоли DGC также имели более высокую скорость нарушения регуляции важных сигнальных путей рака по сравнению с кишечным типом, включая контрольную точку клеточного цикла G2 / M, mTOR , MYC и сборку митотического веретена. Наконец, образцы DGC имели более высокие уровни Т-клеток памяти CD4 с более низкими уровнями цитотоксических лимфоцитов, моноцитов, NK-клеток, миелоидных дендритных клеток и нормальных перитонеальных фибробластов.

Что же касается обычно тестируемых биомаркеров в GC, сверхэкспрессия или амплификация HER2 менее часто наблюдается в DGC (6,2% против 32% в кишечном типе) и, по-видимому, исключают друг друга с мутациями RHOA. Кроме того, DGC вряд ли будет микросателлитно-нестабильным (MSI-H). Другие молекулярные биомаркеры, которые были связаны с DGC, включают изменения в пути PI3K / Akt / mTOR (такие как сверхэкспрессия фосфорилированных mTOR и HER , а также амплификации FGFR, приводящие к PI3K/ Akt и сверхэкспрессии или амплификации c- MET. С другой стороны, сверхэкспрессия VEGF / VEGFR , что связано с активацией NF-кВ с помощью H. Pylori, чаще ассоциируется с IGC.

[albert52]

Вставка.

Кластеризации путей развития РЖ

Выделяют три подтипа РЖ на основе кластеризации путей: иммунодепривированный (ImD), обогащенный стромой (StE) и иммунообогащенный (ImE). ImD показал низкую иммунную инфильтрацию, высокую активность репарации повреждений ДНК, высокий уровень анеуплоидии опухоли, высокую внутриопухолевую гетерогенность (ITH) и частые TP53 мутации. StE демонстрировал высокие стромальные сигнатуры, низкую активность репарации повреждений ДНК, стабильность генома, низкий уровень ITH и плохой прогноз. ImE имел сильную иммунную инфильтрацию, высокую активность репарации повреждений ДНК, высокую нагрузку опухолевых мутаций, преобладание микросателлитной нестабильности, частые мутации ARID1A , повышенную экспрессию PD-L1 и относительно благоприятный прогноз.

ImD сильно экспрессировал пути репарации повреждений ДНК и клеточного цикла, в то время как он слабо экспрессировал иммунные, стромальные и другие онкогенные (PI3K-Akt, Wnt и TGF-β) пути, а у StE все наоборот. ImE показал повышенную активность иммунных путей, путей восстановления повреждений ДНК и клеточного цикла и сниженную активность стромальных, PI3K-Akt, Wnt и сигнальных путей TGF-β.

Таргетные методы лечения РЖ, такие как нацеливание на HER2, EGFR, FGFR, KIT, c-Met, VEGFR и CLDN18.2, в настоящее время находятся на стадии изучения, хотя большинство таргетных методов лечения продемонстрировали умеренный эффект или резистентность к лекарствам. А иммунотерапия рака, такая как ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI), достигла успеха в лечении различных рефрактерных опухолей, включая подтип MSI GC. Тем не менее, только часть больных раком показала благоприятный ответ на иммунотерапию. При этом «горячие» опухоли с высокой иммунной инфильтрацией часто демонстрируют более активный ответ на иммунотерапию, чем «холодные» опухоли с низкой иммунной инфильтрацией.
Отметим, что опухоли ImE, которые имели значительно более высокую частоту мутаций ARID1A, B2M, CASP8, CIC и RNF43, с большей вероятностью реагируют на ICI, чем другие подтипы. Дело в том, что ImE имеет наибольшую иммунную инфильтрацию и уровни экспрессии PD-L1, которые являются детерминантами, управляющими ответом на ICI.

Дефицит репарации несоответствия ответственен за MSI, тип мелкомасштабной геномной нестабильности, обнаруживаемой примерно в 20% GCs. Система репарации несоответствий (MMR - mismatch repair) поддерживает стабильность генома путем исправления неправильных пар оснований, образующихся во время репликации ДНК. Ее функция заключается в устранении ошибок репликации ДНК, возникающих при делении клеток, в ситуациях, когда во время построения новой нити происходит ошибочная вставка некомплиментарного нуклеотида (например, вместо гуанина к цитозину встраивается тимин), в результате чего возникает несоответствие (mismatch).
Система MMR включает в себя белки MSH2 и MSH6, формирующие первый гетеродимер, отвечающий за поиск ошибок в ДНК, а также белки MLH1 и PMS2, составляющие второй гетеродимер, который в месте обнаруженной ошибки комплексом MS2/MSH6 присоединяется к нему. В результате этого происходит активация экзонуклеазы, которая вырезает участок с ошибкой. Далее ДНК-полимераза правильно достраивает эту нить ДНК. Молекулярные нарушения в функционировании хотя бы одного из белков MMR, а также в гене EPCAM (делеция 3´- конца которого вызывает эпигенетическое гиперметилирование промотора гена MSH2), приводит к прекращению работы всей системы.

Напротив, дефицит гомологичной рекомбинации ответственен за CIN, тип крупномасштабной нестабильности генома, проявляющийся примерно в 50% GCs. Гомологи́чная рекомбина́ция, или о́бщая рекомбина́ция, — тип генетической рекомбинации, во время которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя похожими или идентичными хромосомами. Это наиболее широко используемый клетками способ устранения двух- или однонитевых повреждений ДНК.
Разрыв двух нитей ДНК приводит к тому, что 5'-концы непосредственно рядом с повреждением удаляются. Следующий шаг заключается во внедрении или инвазии 3'-конца повреждённой цепи в другую, целую ДНК, используемую в качестве матрицы. Дальнейшая последовательность событий может идти двумя путями (описанными ниже), известными как DSBR или SDSA. Гомологическая рекомбинация, происходящая во время репарации ДНК, как правило, приводит к восстановлению молекулы в том же виде, в котором та находилась до повреждения.

Эффективность репарации ДНК падает со снижением скорости гомологической рекомбинации, что также может привести к раку, например, в случае BRCA1 и BRCA2[en] — двух похожих опухолевых супрессоров, чья неисправность связана с значительно повышенной вероятностью возникновения рака груди и яичников.

Иммунная цитолитическая активность представляет собой способность цитотоксических Т-клеток и естественных клеток-киллеров уничтожать опухолевые клетки, что соответствует среднему уровню экспрессии двух маркерных генов ( GZMA и PRF1 ) в опухоли. Три подтипа GC имели значительно разные иммунные оценки: ImD <StE <ImE во всех трех наборах данных. Уровни экспрессии большинства генов человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) показали закономерность: ImD <StE <ImE. Иммуноцитолитическая активность была наибольшей при ImE и наименьшей при ImD. Эти данные подтвердили, что ImE и ImD имели самый высокий и самый низкий противоопухолевый иммунитет соответственно.

У StE была значительно более высокая доля покоящихся Т-клеток памяти CD4, покоящихся тучных клеток и иммуноингибирующих макрофагов M2, но более низкая доля активированных Т-клеток памяти CD4 и иммуностимулирующих макрофагов M1, чем у ImE. Более того, при СтЭ доля покоящихся тучных клеток и макрофагов М2 была значительно выше, а доля активированных тучных клеток ниже, чем при ImD. Это показывает, что StE, вероятно, будет демонстрировать более сильные иммуносупрессивные сигнатуры, чем другие подтипы.

Уровни экспрессии 194 сигнатур стромальных генов между тремя подтипами GC показали, что большинство из них были более выражены в StE, чем ImD и ImE. Напротив, чистота опухоли (% опухолевых клеток) демонстрировала противоположную тенденцию: ImD > ImE > StE, что указывает на то, что ImD и StE имели самую высокую и самую низкую чистоту опухоли соответственно. Впрочем, ассоциации подтипов GC с иммунными и стромальными сигнатурами не зависят от чистоты опухоли.

[albert52]

Продолжим конкретные формы рака с рассмотрения рака толстой кишки (РТК или CRC).

Нормальная толстая кишка состоит примерно из миллиона крипт Либеркюна, каждая из которых содержит около 2 тыс. клеток, включающих энтероциты, энтерохромаффиноциты, бокаловидные клетки и клетки Панета. Предполагаемые стволовые клетки находятся в узком промежутке вблизи основания крипты. Эти стволовые клетки движутся вниз и дифференцируются в клетки Панета или наверх и превращаются в пролиферативные, которые дают начало 3 типам клеток: энтероцитам, бокаловидным клеткам и энтерохромаффиноцитам, формирующим кишечную ворсинку.

Клетки эпителия кишечника обновляются примерно 1 раз в 5 дней. Данные стволовые клетки делятся ассиметрично, порождая эпителиальные клетки всех типов. Число длительно живущих стволовых клеток составляет 4–6 на 1 крипту.
В толстой кишке происходит миграция клеток - эпителиальные клетки, делящиеся в нижней половине кишечных крипт, мигрируют на поверхность, откуда они в конце концов выталкиваются в просвет кишки. По мере того как эти клетки мигрируют к устью крипты, они сначала заполняются секреторными вакуолями; однако, еще не достигнув поверхности, они теряют вакуоли и становятся типичными цилиндрическими клетками, микроворсинки которых образуют щеточную каемку. В аноректальном канале, в области границы ректального и анального эпителия, кишечные крипты не обнаруживаются.

Распостраненность рака толстой кишки диктует необходимость выявления их на этапе предраковых изменений. До недавнего времени считалось, что в качестве таковых могут выступать только так называемые диспластические полипы (аденомы тубулярные, тубуло-ворсинчатые, ворсинчатые), причем чем более выражен ворсинчатый компонент, тем интенсивнее выражена дисплазия, а значит, тем выше потенциал злокачественности. Ворсинчатая аденома кишечника может достигать 10 см в диаметре. Впрочем, хотя ворсинчатые аденомы гораздо чаще, чем тубулярные, содержат очаги инвазии, но сам по себе ворсинчатый тип при небольших размерах аденомы не повышает риск развития рака.
Аденомы — это внутриэпителиальные опухоли, варьирующие от маленьких полипов на ножке до крупных плоских образований. Аденомы одинаково часто наблюдаются у мужчин и женщин, их частота коррелирует с частотой аденокарцином толстой кишки, при этом локализация и распределение аденом и аденокарцином в толстой кишке сходна.
Цитологическими признаками дисплазии эпителия в полипах являются гиперхромия ядер, его удлинение и псевдостратификация (псевдослои). Эти изменения лучше всего различимы в поверхностных участках аденомы и часто сопровождаются уменьшением количества бокаловидных клеток.

Представители другой группы новообразований — гиперпластические полипы — считались не способными к перерождению в аденокарциному. Однако сегодня доказано, что они представляют собой гетерогенную группу образований с различным неопластическим потенциалом. Самые опасные — зубчатые образования толстой кишки. Зубчатая аденома имеет характерную поверхность, на которой располагаются зазубренные элементы эпителия. Зубчатость формируется за счет «наползания» пролиферирующих клеток друг на друга, предположительно вследствие угнетения апоптоза.

Аденомы могут образовываться в любом отделе толстого кишечника. Исследования дают следующие результаты частотности локализации аденоматозных полипов: 25 % — прямая кишка; 25 % — сигмовидная кишка; 18 % — нисходящая ободочная; 13 % — восходящая ободочная; 11 % — поперечная ободочная; 7 % — слепая. Данная патология встречается довольно часто, она составляет от 25 % до 40 % от всех новообразований полиповидного типа. Причем 15 – 58 % — это поражение множественными аденомами, процентное содержание которых увеличивается с возрастом.
Если говорить о возрастной группе 50 – 60 – летних людей, поражены этим заболеванием будут 40 % женщин и 50 % мужчин. Люди в возрасте до 30 лет редко сталкиваются с этим заболеванием, поэтому его оправданно считают болезнью пожилого населения. Семейный полипоз, когда количество полипов варьируется в рамках 30 – 100, сегодня выявляется все чаще.

Остановимся поподробнее на гиперпластических полипах.
Гиперпластические полипы (НР): на них приходится от 28 до 42 % всех полипов толстой кишки. Чаще всего они локализуются в левой половине толстой кишки, преимущественно в дистальных отделах, хотя 10—15% полипов располагаются в восходящей и поперечной ободочной кишке; они могут носить множественный характер и не иметь клинических проявлений.

Из гиперпластических полипов чаще всего встречается микровезикулярный тип, характеризующийся наличием мелких капель муцина в цитоплазме большинства клеток. Богатый бокаловидными клетками тип встречается несколько реже и преимущественно построен из клеток с обильной светлой цитоплазмой, заполненной муцинами. Пролиферативная зона и зубчатость в нем выражена сравнительно слабо.
В гиперпластическом полипе возможна только минимальная клеточная атипия. Отметим, что микровезикулярный тип может быть предшественником зубчатой аденомы/полипа на широком основании (sessile serrated adenoma/polyp — SSA/P), а богатый бокаловидными клетками — традиционной зубчатой аденомы. Любой полип, располагающийся проксимальнее селезеночного изгиба и имеющий размер более 1 см, рекомендуется расценивать как SSA/P. Частота встречаемости SSA/P составляет 2—5% колоректальных полипов и 15—25% всех зубчатых образований.

Гистологически SSA/P характеризуется распространением зубчатости на всю глубину крипт вплоть до базальных отделов и деформацией крипт с появлением признаков патологического ветвления, расширения базальных отделов, горизонтального роста вдоль мышечной пластинки с образованием расширений в виде буквы L или перевернутой буквы Т. Зубчатость обусловлена выбуханием апикальной части цитоплазмы в просвет крипты (см. выше). Зона пролиферации асимметрична, часто расположена на одной из стенок, смещена в среднюю треть крипты.
С 2005 г. диагностическим критерием для SSA/P считалось наличие не менее 10% измененных крипт. Согласно рекомендациям ВОЗ 2010 г., таким критерием признавалось наличие не менее двух измененных желез, а современным рекомендациям — наличие даже одной измененной железы при ее зубчатости. Показано, что 15% SSA/P прогрессировали в колоректальную аденокарциному или дисплазию высокой степени.
Есть предположение, что существует последовательность: HP → SSA/P → SSA/P с дисплазией → рак. Чаще всего этот каскад наблюдается в проксимальных отделах толстой кишки; есть сведения о повышении частоты мутаций CIMP и BRAF по мере продвижения от прямой кишки к проксимальным отделам.

Традиционная зубчатая аденома (traditional serrated adenoma — TSA) в большинстве случаев имеет вид полиповидного образования на ножке (Ip) или на широком основании (Is), также встречаются неполиповидные приподнятые образования (0—IIa). Есть данные, что полиповидные формы более характерны для дистальной части толстой кишки, а неполиповидные — для проксимальной. Частота встречаемости TSA, по данным разных исследований, составляет 1,2—7%. Отметим, что 31,3% TSA имеют в качестве предшественников SSA/P (преимущественно проксимальное расположение) и 52,3% гиперпластические полипы (преимущественно дистальное расположение. Они редко имеют клинические проявления. Морфологически характеризуются ворсинчатым строением, ворсины отечны, булавовидно расширяются на концах; формируются эктотипированные крипты, отходящие от основной под прямым углом и не достигающие мышечной пластинки.
Им присуща специфическая мутация — гиперметилирование гена «починки» ДНК MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase). ТSA часто прогрессируют в зубчатые карциномы муцинозного или трабекулярного типа. Рост таких карцином более агрессивен по сравнению с карциномами, развившимися из классических аденом.

Под зубчатым полипозом понимают наличие в толстой кишке 5 и более зубчатых образований, расположенных проксимальнее сигмовидной ободочной кишки (2 или более из которых размером более 10 мм), либо наличие любого числа зубчатых образований, расположенных проксимальнее сигмовидной ободочной кишки у лиц, чьи родственники первой линии родства страдают зубчатым полипозом, либо наличие 20 и более зубчатых образований любого размера, локализованных в любых отделах толстой кишки.
Существует два варианта заболевания:
(1) с множеством SSA/P, в том числе и крупных, имеющих тенденцию к проксимальному расположению и
(2) с множеством типичных гиперпластических полипов (5 мм и менее), распределенных по всем отделам толстой кишки. Первый вариант более опасен с точки зрения последующей малигнизации.

Сидячая зубчатая аденома – это сравнительно новый вид полипов толстой кишки. Эти полипы обычно встречаются в правых отделах толстой кишки и не проявляют себя клинически. Обычно сидячая зубчатая аденома достигает больших размеров и имеет уплощенную форму, что затрудняет ее обнаружение при эндоскопическом исследовании (уплощенное, слабо возвышающееся над поверхностью окружающей слизистой, стелющееся образование). Специалисты считают, что сейчас примерно треть всех случаев рака толстой кишки берут свое начало из таких зубчатых аденом.

Другая специфическая форма CRC, рак, ассоциированный с колитом (CAC), чаще всего появляется у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) и составляет около 2% от CRC и имеет сходство со спорадическим/семейным CRC.

[albert52]

Продолжим.

Хотя усиленный несистематический скрининг молодых людей может способствовать выявлению заболеваемости, раннее начало CRC (у пациентов в возрасте 50 лет и ниже) может быть вызвано многочисленными распространенными провоцирующими факторами, в том числе глобальным принятием вестернизированной диеты, хроническим стрессом и широкое использование антибиотиков с изменением микробиоты кишечника.

Различия в клинических исходах и чувствительности к лекарствам зависят от локализации рака в толстой и прямой кишке. Соответствующие способствующие факторы включают их различные физиологические функции, кишечный микробиом, региональные типы иммунных клеток, диетические канцерогены, время обнаружения болезни и факторы онтогенеза.
Так, проксимальные спорадические опухоли толстой кишки, которые чаще диагностируются у женщин (51–62% случаев) и у афроамериканцев, демонстрируют более высокую стадию TNM при первом диагнозе (TNM — это система обозначений, описывающая стадию рака, возникающего из солидной опухоли, с использованием буквенно-цифровых кодов), имеют тенденцию к высоким уровням полногеномного гиперметилирования промотора, называемого фенотипом метилатора островков CpG (CIMP), проявляют микросателлитную нестабильность (MSI) из-за дефектных механизмов репарации несоответствия ДНК (dMMR), чаще мутируют в KRAS и BRAF и имеют худший прогноз. Напротив, дистальные колоректальные опухоли с большей вероятностью проявляются хромосомной нестабильностью (CIN) и имеют более благоприятный прогноз.

Описано 2 различных генетических пути канцерогенеза в толстой кишке. Первый — это путь АРС/b-катенина, который связан с геном WNT и классической последовательностью аденома-карцинома. Второй — путь микросателлитной нестабильности, который связан с дефектом системы репарации ДНК. Оба пути приводят к постепенному накоплению многочисленных мутаций, но вовлеченные гены и механизмы, посредством которых накапливаются мутации, различны.

Классическая концепция развития КРР, предложенная B. Vogelstein, основана на возникновении его из традиционных аденом (тубулярных, ворсинчатых и тубуловорсинчатых) в результате активации Wnt сигнального каскада из-за инактивирующей мутации в гене APC (adenomatous polyposis coli), приводящей к активации генов KRAS/BRAF или активирующей мутации в гене, кодирующем β-катенин. Впрочем, активирующие мутации в онкогенах KRAS/BRAF могут быть первичными и появляться независимо от гена APC. Этот механизм канцерогенеза характерен для органов с интенсивным делением клеток. Для развития аденомы обе копии гена АРС должны быть функционально неактивными как вследствие мутации, так и из-за эпигенетических воздействий. При утрате функции АРС ß-катенин накапливается и переносится в ядро, где активирует транскрипцию генов MYC и циклина D1, которые запускают пролиферацию.

Wnt-сигнальный путь активирует транскрипционные факторы ядерного комплекса β-катенина и TCF/LEF (T cell factor/lymphoid enhancer factors), которые регулируют транскрипцию большого числа генов, вовлеченных в поддержание гомеостаза тканей, эмбриональное развитие. Также Wnt-сигнальный путь участвует в формировании нормальной слизистой оболочки толстой кишки (см. ниже).
Последующие дополнительные мутации, включая активирующие мутации гена Kras, приводят к активации роста и препятствуют апоптозу клеток. Мутация Kras является последним событием в цепи канцерогенеза. Это подтверждается тем, что эти мутации присутствуют только в 10% аденом диаметром менее 1 см, но обнаруживаются в 50% аденом диаметром более 1 см и в 50% инвазивных аденокарцином.

Прогрессирование опухоли также сопровождается мутациями или делецией других генов-супрессоров опухолей — SMAD2 и SMAD4, которые являются эффекторами сигнального пути TGF-ß. Поскольку сигнал TGF-ß в норме подавляет клеточный цикл, утрата этого гена может приводить к неконтролируемому клеточному росту.

Отметим еще фермент СОХ-2, высокая экспрессия которой определяется в 90% карцином толстой кишки и в 40-90% аденом толстой кишки. СОХ-2 необходима для выработки простагландина Е2, который стимулирует пролиферацию эпителия, особенно после его повреждения. Интересно, что экспрессия СОХ-2 регулируется TLR4 (Toll-like receptor 4), который распознает липополисахариды и также избыточно экспрессируется в аденомах и карциномах.

Мутации гена-супрессора опухолей р53 определяются в 70-80% случаев рака толстой кишки, но редко наблюдаются при аденомах, позволяя предположить, что мутации р53 возникают на поздних этапах прогрессирования опухоли. Причиной утраты функций р53 и других генов-супрессоров опухолей часто являются делеции, указывающие на то, что хромосомная нестабильность (chromosomal instability — CIN) — типичный признак опухолей с путем АРС/Р-катенина. Общая доля опухолей толстой кишки, возникших по данному механизму, составляет примерно 60 %. Этот путь характерен и для случаев с наследственным аденоматозным полипозом и наследственным КРР.

[albert52]

Продолжим.

У пациентов с нарушением работы системы репарации ошибок репликации ДНК вследствие утраты генов, исправляющих эти ошибки (mismatch repair гены, MMR — MLH1 и MLH2), в микросателлитных последовательностях накапливаются мутации. Такое состояние называют микросателлитной нестабильностью (мутаторным фенотипом); она может быть высокой (MSI-H) или низкой (MSI-L), при ее отсутствии принято говорить о стабильности (MSS). Кстати, геном человека содержит 50-100 тыс. микросателлитов, длина которых увеличивается во время каждой репликации ДНК.

Эти мутации, как правило, являются «молчащими», т.к. микросателлиты обычно расположены в некодирующих участках ДНК. Однако некоторые микросателлитные последовательности располагаются в кодирующем участке или промоторной зоне генов, участвующих в регуляции клеточного роста, например генов рецептора TGF-ß II типа и проапоптотического белка ВАХ. TGF-ß, как я уже yпоминал, подавляет пролиферацию эпителиальных клеток толстой кишки, утрата его, а также ВАХ может повышать выживаемость генетически аномальных клеточных клонов. Здесь также часто определяются мутации онкогена BRAF, и сайленсинг (подавление транскрипции) различных групп генов вследствие гиперметилирования островков CpG.

Такие нарушения часто выявляют в плоских зубчатых аденомах, обычно в проксимальных отделах кишки; некоторые из них могут быстро прогрессировать в рак (малигнизироваться), несмотря на то, что размер их остается небольшим. При отсутствии аденоматозного строения такие образования считаются раком «de novo», а их патогенез называют «зубчатым путем канцерогенеза». Отметим, что колоректальные карциномы, развившиеся по зубчатому пути, требуют особого режима химиотерапии.

В целом такой метиляторный фенотип выявляется у 47—60% гиперпластических полипов, 75—77% SSA/P и 31—80% TSA. Микросателлитная нестабильность определяется у 64% гиперпластических полипов, 23—54% SSA/P и 30—56% TSA. В опухоли, развивающейся из TSA дистальной части толстой кишки, начальной является мутация гена KRAS, что встречается у 13—31% гиперпластических полипов, 3—12,5% SSA/P и 24—55% TSA.

Опухоли с высоким MSI - микросателитной нестабильностью (MSI-H) обладают многими точечными мутациями, которые создают обильные неоантигены, которые могут вызывать воспалительный фенотип, характеризующийся плотной инфильтрацией лимфоцитов. Что же касается хромосомная нестабильность (CIN), то у людей при старении в эпителии кишечника происходит прогрессирующая эрозия теломер, а дисфункция теломер (анафазные мостики) была зарегистрирована при переходе от аденомы к раку, что указывает на то, что теломеры играют роль в развитии CIN на ранних стадиях CRC человека. Наконец, прогрессирование рака связано с реактивацией теломеразы, которая присутствует в 85–90% всех типов рака, включая CRC.

Отметим, что на ранних стадиях рака груди член семейства TGF-β BMP7 репрессирует обратную транскриптазу теломеразы человека (hTERT) посредством BMP-рецепторов II и SMAD3-зависимым образом. Хроническое воздействие BMP7 на раковые клетки вызывает укорочение теломер раковых клеток и последующий апоптоз, то есть на ранних стадиях рака TGF-β оказывает супрессивное действие, но на поздних стадиях наоборот, способствует ЭМП (см. выше).

Отметим, что в модели «APC-TP53 - KRAS», чаще всего наблюдающейся на
фоне хронического колита, частые мутации TP53 можно обьяснить его постоянной активацией, что требует его открытой конфигурации и высокого уровня АФК. Вообще, мутации наблюдаются обычно только у активных генов, так как к молчащим генам плотно прилегают гистоны, защищая их от повреждений. Наиболее открыты гены дифференциации (надстройки), так как для их чтения требуется больше кофакторов, чем для генов инфраструктуры.

Следует отметить, что мутации в генах KRAS и BRAF являются
взаимоисключающими. Карциномы толстой кишки с мутацией BRAF имеют худший прогноз, чем Kras-мутантные опухоли из-за высокого уровня метилирования ДНК, особенно с фенотипом CpG Island Methylator (CIMP). Дело в том, что такие островки особенно важны в генах надстройки из-за необходимости их тонкой настройки, и их постоянное метилирование нарушает работу этих генов. Кроме того, BRAFV600E активирует MEK-ERK, который, в свою очередь, активирует онкогенные факторы транскрипции, такие как Mус и NF-kB.
Кстати, как я уже упоминал, мутации в генах BRAF и KRAS практически не сочетаются, хотя на перый взгляд опухолевым клеткам это выгодно - гены надстройки слабеют, а инфрастуктуры, наоборот, усиливаются. Видимо для раковых клеток так много счастья, особенно при интактном р53, уже слишком - возникает апоптоз (синтетическая летальность).

Такие опухоли, так же как и опухоли с метилированием островков CpG, часто локализуются в проксимальном отделе ободочной кишки. Но в целом общие гистологические характеристики аденокарцином дистального и проксимального отделов толстой кишки сходны. Большинство опухолей состоят из высоких цилиндрических клеток, напоминающих диспластичный эпителий, обнаруживаемый в аденомах.

Проведено иммуногистохимическое исследование аденокарциномы толстой кишки. При этом клеточный состав опухоли условно можно разделить на 4 популяции:
1) стволовые непролиферирующие (ALDH1+, Ki-67–);
2) стволовые пролиферирующие (ALDH1+, Ki-67+);
3) амплифицирующиеся (ALDH1–; Ki-67+);
4) дифференцирующиеся (ALDH1–; Ki-67–).
Соотношение данных популяций в среднем составляет 9:1:60:30. Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей — пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Кроме того, часть клеток имеет экспрессию рецептора хемокина CXCR4, который в литературе при изучении других локализаций показывал связь с развитием метастазов.

Внутрислизистая карцинома развивается в том случае, когда диспластические эпителиальные клетки проникают через базальную мембрану в собственную или мышечную пластинку слизистой оболочки. Поскольку в слизистой оболочке толстой кишки отсутствуют лимфатические сосуды, внутрислизистая карцинома обладает очень низким метастатическим потенциалом, поэтому тотальная полипэктомия является эффективным методом лечения.

Низкодифференцированные опухоли и опухоли с муцинозной дифференцировкой имеют н***агоприятный прогноз, определяемый двумя наиболее значимыми факторами — глубиной инвазии опухоли и наличием метастазов в лимфоузлах. Инвазия в мышечную оболочку и метастазы в лимфатических узлах значительно снижают выживаемость.

Наследственный неполипозный рак толстой кишки (HNPCC), также известный как синдром Линча, был описан при наблюдении семейных случаев злокачественных опухолей различной локализации, включая толстую кишку и прямую кишку, эндометрий, желудок, яичники, мочеточники, головной мозг, тонкую кишку, желчные пути и кожу.
HNPCC вызван наследственными мутациями генов, кодирующих белки, ответственные за определение, вырезание и репарацию повреждений, возникающих при репликации ДНК. Существуют по меньшей мере 5 репарационных генов, но в большинстве наблюдений HNPCC мишенями являются гены MSH2 и MLH1. Пациенты с HNPCC наследуют мутантный аллель репарационного гена и один нормальный аллель.
После утраты второго аллеля вследствие мутации или эпигенетического сайленсинга («выключение» гена, подавление его активности) дефект репарации приводит к накоплению мутаций, которых становится в 1000 раз больше, чем в норме, главным образом в областях, содержащих короткие нуклеотидные повторы ДНК (микросателлиты). и которые представляют собой самые частые участки мутаций при HNPCC. Нарушения репарации приводят к микросателлитной нестабильности.

[albert52]

Вставка

Хромосомная нестабильность (CIN)

Большинство солидных опухолей являются анеуплоидными, и многие хромосомы неправильно расщепляются с очень высокой частотой (вплоть до одного раза за каждые 1-5 клеточных делений) в явлении, называемом хромосомной нестабильностью (CIN), которая определяется как постоянно высокая скорость потери и приобретения целых хромосом. Отметим, что массивная неправильная сегрегация хромосом, вызванная сбоем контрольной точки или мультиполярной анафазой, приводит к летальному исходу.
CIN представляет собой потерю точности сегрегации хромосом в митозе, который в норме тщательно организован, чтобы гарантировать, что все сестринские хроматиды сегрегируют в противоположные дочерние клетки. Центральное место в этой хореографии занимает слипчивость сестринских хроматид, которая устанавливается во время репликации ДНК путем отложения когезинового комплекса. Надлежащая сегрегация хромосом требует, чтобы слипчивость поддерживалась на протяжении фаз G2 и M клеточного цикла, а затем резко нарушалась в начале анафазы.

Хромосомы, которые не прикреплены должным образом к микротрубочкам веретена, испускают сигнал для поддержания активности циклин-зависимой киназы, которая ингибирует начало анафазы и сохраняет сцепление сестринских хроматид. Как только все хромосомы достигают надлежащего би-ориентированного прикрепления к микротрубочкам веретена, SAC (контрольная точка сборки веретена) удовлетворяется, и разделение сестринских хроматид резко и синхронно индуцируется на всех хромосомах механизмом клеточного цикла, который протеолитически расщепляет когезиновый комплекс. Наконец, в клетках человека каждая кинетохора прикрепляется в среднем к 20 микротрубочкам, и все эти микротрубочки должны ориентироваться на один и тот же полюс веретена, чтобы поддерживать правильное расхождение хромосом.

Узкий диапазон регуляции динамики кинетохор-микротрубочек по мере продвижения клеток через митоз делает их чувствительной мишенью для нарушения митотической точности. Так, прикрепление кинетохор к микротрубочкам более стабильно в опухолевых клетках с CIN, чем в хромосомно стабильных диплоидных клетках, причем стохастический характер прикрепления кинетохор к микротрубочкам приводит к частым неправильным прикреплениям, при которых отдельные кинетохоры одновременно связываются с микротрубочками, отходящими от обоих полюсов веретена. Это не воспринимается SAC и, если это не исправить, может вызвать миграцию сестринских хроматид к одному и тому же полюсу веретена в анафазе, что приводит к неправильной сегрегации хромосом. Впрочем мутации, которые нарушают функцию SAC, довольно редко встречаются в CIN опухолях человека.

Острое истощение когезинов или регуляторов когезии Sgo1 и сепаразы (фермента, расщепляющего когезины для инициации анафазы) с помощью РНК-интерференции увеличивает количество тетраплоидных клеток.
Отметим, что когезиновые гены редко мутируют. Тем не менее возможно что доминантные мутации в субъединицах cohesin увеличивают неправильную сегрегацию хромосом, предотвращая своевременное разделение хромосом. Неправильное расхождение хромосом способствует онкогенезу в клетках. которые приобрели дополнительные мутации. Так, потеря хромосом является известным механизмом выявления рецессивных мутаций в генах-супрессорах опухолей человека.

Наиболее распространенным митотическим дефектом является отставание хромосом в анафазе, причем частота отставания хромосом во время анафазы увеличивается в клетках с ослабленной активностью SAC, указывая на то, что у этих клеток не было достаточно времени, чтобы скорректировать все меротелиальные прикрепления до начала анафазы. APC часто мутирует при раке толстой кишки, а клетки с мутациями в APC демонстрируют высокие показатели отставания хромосом в анафазе.
Амплификация центросом возникает в результате избыточной экспрессии киназы Aurora A или вирусной инфекции. Впрочем, список белков центромер/кинетохор, возмущение которых снижает точность сегрегации из-за повышения неправильного прикрепления кинетохор-микротрубочек, быстро растет. Также индукция дополнительных центросом в хромосомно стабильных клетках была достаточна для неправильной сегрегации хромосом .

Когда диплоидные клетки становятся толерантными к недиплоидному геному за счет потери p53, они проявляют CIN после первоначальных событий неправильной сегрегации хромосом, показывая, что возмущение хромосомного содержимого (и, следовательно, множество уровней транскриптов) может иметь циклический эффект, вызывая постоянное состояние CIN.

В дополнение к белкам, которые функционируют непосредственно в процессе расхождения хромосом во время митоза, существуют многочисленные регуляторы клеточного цикла, связанные с CIN. Так, нарушение контрольных точек клеточного цикла может позволить клеткам с неправильно сегрегированными хромосомами продолжать клеточный цикл. Также циклин E регулирует удвоение центросом во время клеточного цикла, а дополнительные центросомы способствуют CIN. Другим примером является белок-супрессор опухолей Rb, который регулирует активатор транскрипции E2F. Одной из мишеней E2F является ген Mad2, и потеря Rb приводит к сверхэкспрессии Mad2, которая индуцирует CIN. Также FoxM1 активирует транскрипцию многих митотических белков, включая циклин B, CENP-F и Plk-1, и потеря FoxM1 может вызвать CIN путем изменения экспрессии одного или нескольких из этих белков .

Из-за постоянной перетасовки хромосом опухолевые клетки с CIN постоянно исследуют генетический ландшафт с почти неограниченным числом комбинаций. В то время как некоторые комбинации хромосом могут не давать селективного преимущества или недостатка, другие могут обеспечивать преимущества роста клеток в микроокружении опухоли, особенно под селективным давлением, оказываемым химиотерапией.

Анеуплоидия — это состояние, при котором число хромосом в клетке отклоняется от кратного гаплоидному числу хромосом. Анеуплоидные опухолевые клетки приобретают толерантность к недиплоидным геномам, что позволяет им эффективно размножаться, поскольку они в связи с CIN постоянно неправильно сегрегируют отдельные хромосомы. Однако толерантность ограничена, поскольку анеуплоидные опухолевые клетки погибают, когда большое количество хромосом неправильно сегрегирует в одном цикле клеточного деления. Таким образом, стратегии, которые поднимают неправильную сегрегацию хромосом за пределы допустимого уровня, могут быть терапевтически полезными.

[albert52]

Продолжим.

CIN была признана источником генетической изменчивости, способствующей адаптации опухоли к стрессовой среде и цитотоксическим противораковым препаратам. CIN может быть сильно онкогенным, но определенные уровни CIN могут иметь противоположные эффекты в разных тканях. В то время как во время эмбриогенеза почти все анеуплоидии летальны и уровни анеуплоидий в нормальных тканях очень низкие, хромосомные аберрации наблюдаются в 70-90% солидных опухолей.
CIN таким образом является общим признаком солидных опухолей и может быть классифицирован как числовой CIN или структурный CIN. Числовая CIN характеризуется увеличением или потерей целых хромосом (анеуплоидия), в то время как структурная CIN характеризуется увеличением или потерей фракций хромосом .

Опухоли больше всего выигрывают от средних показателей CIN, поскольку низкие показатели CIN не допускают какой-либо эволюции кариотипа, а слишком высокие показатели CIN препятствуют клональному отбору хромосом, когда окружающая среда изменилась. Что касается толстого кишечниеп, то умеренная CIN наиболее эффективна для индуцирования анеуплоидий, способствующих инициации или росту аденомы. Более высокие степени CIN приводят к анеуплоидным популяциям в здоровой ткани кишечника, причем по крайней мере часть анеуплоидных популяций, индуцированных CIN, в аденомах в виде пролиферативных клеток. Гиперпролиферация крипт может быть адаптивным ответом на гибель или остановку клеток из-за высокого CIN.

Анеуплоидия относится к состоянию аномального числа хромосом, которое может быть стабильным или нестабильным. Нестабильная анеуплоидия может способствовать одновременному росту различных субпопуляций опухоли, что приводит к межопухолевой и внутриопухолевой геномной гетерогенности. Кроме того, при раке с повышенным числовым и структурным CIN также наблюдается хаос в геноме. Хаос генома, определяемый как процесс сложной быстрой реорганизации генома, характеризуется наличием экстремальных структурных и числовых хромосомных изменений. Многие из этих хромосомных изменений являются единовременными аномалиями (NCCA), и поскольку они не являются клональными (клональные хромосомные изменения - CCA), они обычно игнорируются.

ССА определяются как хромосомные изменения, наблюдаемые по крайней мере дважды в пределах от 20 до 40 случайно исследованных митотических фигур (диапазон встречаемости более 30%). NCCA определяются как единовременные хромосомные изменения, наблюдаемые с частотой менее 4% среди 50–100 митотических фигур и характерные для хаотических геномов. Примеры NCCA включают делеции, транслокации, амплификации генов, инверсии, хромотрипсис, хромоплексию, дицентрические хромосомы и дупликации.

Генетическая структурная вариация в геноме человека может проявляться во многих формах, начиная от однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и заканчивая большими хромосомными аберрантами. Широко распространено существование вариации числа копий (CNV) у людей. CNV определяется как увеличение или уменьшение количества сегментов ДНК размером 1 т.п.н. или больше в геноме человека, что составляет важную часть генетической структурной изменчивости.

Было указано, что, хотя CIN может быть полезным для опухолей, обеспечивая благоприятные изменения, он также может создавать уязвимости, которые можно использовать терапевтически. Фактически, CIN может генерировать «синтетические летальные» взаимодействия конкретно в опухолевых клетках, вызывая генные зависимости, отсутствующие в нормальных клетках. Например, при РМЖ дефицит BRCA1 и BRCA2 приводит к заметной чувствительности к ингибиторам поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP).
PARP играет важную роль в репарации однонитевых разрывов, и считается, что его ингибирование приводит к коллапсу репликационной вилки и двухцепочечным разрывам, репарация которых зависит от гомологичной рекомбинации (см. выше). Примечательно, что из-за того, что носительство мутаций BRCA полностью недостаточно для функции BRCA в опухолях (не в нормальных тканях), ингибиторы PARP, вероятно, будут высоко опухолеспецифичными.

Также CIN-положительные опухоли по своей природе устойчивы к таксанам из-за сходства между путями, которые регулируют разделение хромосом во время митоза, и путями, участвующими в ответах таксанов. Фактически, таксаны функционируют в первую очередь, вмешиваясь в динамику микротрубочек веретена. Когда клетки подвергаются длительному митотическому стрессу в присутствии ядовитых препаратов для микротрубочек, таких как таксаны, SAC в конечном итоге заглушается, и клетки могут выйти из митоза.

Вообще CIN может быть вовлечен в повреждение ДНК, и двухцепочечные разрывы в результате CIN могут быть репарированы путем рекомбинации с мутантным аллелем, а удвоение мутантной хромосомы сопровождается потерей аллеля дикого типа Вообще конкретно в толстой кишке CIN способствует (за счет LOH), а не инициирует образование опухоли.

Для значительного числа генов число копий демонстрируют положительную корреляцию с соответствующим уровнем экспрессии генов. Эта тенденция особенно очевидна для большого числа онкогенов (например, MYC, AKT1, CDK9, KRAS и MDM2) и генов-супрессоров опухолей (например, CDKN2A, RB1, PTEN и TP53). Можно выделить гены с амплифицированным числом копий и повышением уровня экспрессии (AUG) и гены с уменьшенным числом копий и пониженным уровнем экспрессии (DDG; большинство генов (83%) принадлежит AUG.
Так, ген нейрофасцина (NFASC) значительно амплифицируется и сверхэкспрессируется у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), и определена новая роль NFASC в регуляции подвижности клеток и миграции NSCLC. Также заметная связь между CNV и дифференциальной экспрессией генов для FAM60A, TFDP1, CDC25B и MCM2 при раке пищевода.

В целом максимальная доля высококонкордантных генов AUG и DDG (21,62%) была расположена в хромосоме 8, за которой следовала хромосома 1 (16,54%), что согласуется с данными о том, что хромосома 1 обладает наибольшим количеством генов. оказывает сильное влияние на многочисленные заболевания, такие как рак, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. Как и ожидалось, самая маленькая хромосома 21 приобрела наименьший процент высококонкордантных генов - 0,11%.

Потеря аллеля на хромосоме 18q21 была идентифицирована в 70% первичных колоректальных опухолей, особенно при запущенной стадии заболевания. Гены-супрессоры опухоли локализованы в этой области, включая DCC, мутации которого редко выявляются в колоректальных опухолях человека (6%). Выявлена относительно высокая частота аллельного дисбаланса на хромосомах 1p (10%), 5q (55%), 8p (19%), 15q (28%) и 18q (28%), и более чем 90% аденом демонстрируют аллельный дисбаланс хотя бы одного хромосомного плеча. Среди 60–80% полипов наблюдались анеуплоидные изменения, наиболее частые аберрации - потеря хромосом 17p, 19q и 22q и прирост хромосом 7 и 13.

Большая часть AUG была связана с метаболическими путями, связанными с окислительным фосфорилированием и биосинтезом гликозилфосфатидилинозитола (GPI-якоря) , которые проявляют хорошо известную приобретенную функцию белков, связанных с метаболизмом в опухолях . Напротив, DDG были в значительной степени связаны с убиквитин-опосредованным протеолизом, сигнальным путем WNT, дисфункция которого, как правило, приводит к онкогенезу, метастазированию, резистентности и т. д. Интересно, что как AUG, так и DDG значительно обогащены генами убиквитин-протеасомной системы, о которой в последнее время все чаще сообщается, что она тесно связана с раком.

[albert52]

Продолжим.

Клетки со сбалансированным набором всех хромосом, как правило, здоровы, хотя гаплоидные и полиплоидные клетки менее приспособлены, чем диплоидные клетки. По мере того, как клетки отходят от эуплоидии, приспособленность снижается, и больший кариотипический дисбаланс обычно вызывает более тяжелые фенотипы. Так, изменения числа копий гена могут влиять на формирование или функцию белковых комплексов, чувствительных к стехиометрии.

Наиболее вероятным объяснением большинства вредных фенотипов, вызванных анеуплоидией, является гипотеза дозировки генов: увеличение или потеря целых хромосом немедленно изменяет дозировку сотен генов в клетке, тем самым приводя к дисбалансу критических белков. Так, аберрантные кариотипы также вызывают пропорциональные дисбалансы относительных уровней большинства белков. В целом тяжесть фенотипов, вызванных анеуплоидией, коррелирует с количеством приобретенных или утраченных генов.
Ключевым фактором, определяющим чувствительность к дозировке, является склонность некоторых белков к беспорядочным молекулярным взаимодействиям. Гены, которые являются токсичными при избыточной экспрессии, часто имеют много низкоаффинных бинарных партнеров по взаимодействию, что позволяет предположить, что нецелевые взаимодействия, вызванные массовым действием, могут нарушать клеточную приспособленность в анеуплоидных клетках . Такое часто встречается среди пионерных факторах транскрипции и генах инфраструктуры типа с-МУС.

Такой тип беспорядочного взаимодействия может объяснить фенотип усиления функции в сигнальных путях при некоторых видах рака. Например, когда рак легкого с мутациями, активирующими EGFR , лечится ингибитором EGFR , некоторые клетки приобретают лекарственную устойчивость за счет амплификации онкогена MET. Сверхэкспрессия МЕТ приводит к активации киназ ниже по течению от EGFR , которые не зависят от передачи сигналов МЕТ в клетках, содержащих нормальные уровни МЕТ.

Последствия изменения числа копий гена
A. Повышенная доза одного гена, такого как фермент, ограничивающий скорость, может увеличить выход или функцию клеточного пути.
B. Измененная доза гена может повлиять на функцию комплексов, чувствительных к стехиометрии.
C. Белок-белковые взаимодействия зависят от концентрации каждого связывающего партнера. Измененная экспрессия некоторых белков, таких как киназы передачи сигналов, может вызывать беспорядочные молекулярные взаимодействия, которые изменяют клеточные фенотипы.
D. Многим белкам для правильной укладки требуются шапероны. Если анеуплоидия подавляет клеточные шапероны, то неправильно свернутые белки, которые избегают шаперон-зависимой укладки, могут образовывать нерастворимые и потенциально цитотоксические агрегаты.
E. Механизмы контроля качества, в том числе убиквитин-протеасомный путь, гарантируют, что неправильно свернутые или неправильно экспрессированные белки будут быстро заменены. Регулируемая деградация белка также используется для запуска различных клеточных программ, включая прогрессирование клеточного цикла. Избыток некоторых белков может мешать сворачиванию или обороту других белков-клиентов.

Вредные фенотипы, связанные с анеуплоидией, также могут быть результатом синергетических эффектов изменения количества копий нескольких сотен генов одновременно. Анеуплоидия обычно бросает вызов способности клетки поддерживать белковый гомеостаз. Клетки используют ограниченное количество механизмов контроля качества для фолдинга и оборота белка. Например, большинству белков, которые содержат домен WD40, для правильной укладки требуется эукариотический шаперонин TRiC/CCT.
При отсутствии достаточной способности шаперонов вмещать сверхэкспрессированные белки другие клиенты шаперонов могут оставаться развернутыми, что приводит к фенотипам потери функции и образованию потенциально цитотоксических белковых агрегатов .
Неправильно свернутые белки, а также правильно свернутые белки, которые присутствуют в избытке, также могут нарушать клеточные механизмы обмена белков. Было продемонстрировано, что клетки обеспечивают целостность некоторых стехиометрических комплексов за счет быстрой деградации сверхэкспрессированных свободных субъединиц, таких как гистоны и рибосомные белки, то есть большинство белков с коррекцией дозы являются членами белковых комплексов.

Стехиометрический дисбаланс, вызванный анеуплоидией, может сильно нагрузить протеасому. Протеотоксический стресс является ключевым источником антипролиферативных эффектов анеуплоидии. Анеуплоидия также значительно изменяет метаболизм и увеличивает потребности клеток в энергии. Это может быть результатом того, что клетки тратят энергию впустую, транслируя, а затем перерабатывая избыточные белки из дополнительных хромосом.
Также было отмечено, что анеуплоидные клетки продуцируют значительно больше лактата во время пролиферации, чем эуплоидные клетки, фенотип, который они разделяют с раковыми клетками. Такое метаболическое сходство между анеуплоидными первичными клетками и раковыми клетками предполагает, что раковые клетки не полностью избежали стрессов, связанных с анеуплоидией.

[albert52]

Вернемся к раковым стволовым клеткам (CSC)

В основе регуляции стволовых клеток кишечника (ISCs) лежит постоянное перекрестное взаимодействие в нише стволовых клеток кишечника между эпителиальными и мезенхимальными клетками. Эти перекрестные связи опосредуются ключевыми сигнальными путями, включая пути Wnt, Hedgehog (HH), Notch, PI3K и BMP. В частности, факторы, активирующие Wnt, которые секретируются компартментом стромальных миофибробластов, включают такие факторы, как фактор роста гепатоцитов (HGF) и остеопонтин, которые, как было продемонстрировано, вызывают фенотип или активность CSC. Кроме того, TGF-β имеет сходные эффекты, но также вызывает мигрирующий и прометастатический фенотип в раковых клетках либо напрямую, либо через ассоциированные с раком стромальные клетки.

Так как передача сигналов Wnt является важным детерминантом стволовости кишечника, был идентифицирован ген-мишень для Wnt, Lgr5 / GPR49, который экспрессируется исключительно в столбчатых клетках основания крипт (CBCs). Lgr5 / GPR49 может также экспрессироваться в компартменте стволовых клеток других эпителиальных тканей, включая волосяной фолликул, молочную железу и эпителий желудка. Lgr5 также известный как рецептор, связанный с G-белком 49 (GPR49), является «сиротским» рецептором, принадлежащим к семейству G-белковых рецепторов (GPCR). Lgr5 модулирует силу канонической передачи сигналов Wnt посредством связывания со своим лигандом R-spondin. Нацеливание на клетки Lgr5 + антител, конъюгированных с различными лекарствами, демонстрирует высокую эффективность в уменьшении размера опухоли и торможении пролиферации клеток рака толстой кишки.

Другие мишени Wnt включают c-myc и cyclin D1 и вместе с передачей сигналов Notch регулируют переключение ISC на транзитные амплификации клеток-предшественников секреторного эпителия крипт. Также наблюдается повышенная экспрессия гена-мишени Wnt сурвивина, который также считается предполагаемым маркером стволовых клеток.
Предполагается, что дифференцированная активация передачи сигналов Wnt регулирует разные функции дозозависимым образом. Так, инициирующие мутации (APC или β-catenin) приводят к слабой активации передачи сигналов Wnt, достаточной для нарушения нормальной регуляции ISC. Дополнительные соматические мутации, например, как показано для KRAS, или триггеры окружающей среды характорны для наиболее распространенных колоректальных аденокарцином человека. При этом динамическое микроокружение опухоли с гипоксией и воспалением может быть ответственным за варианты опухолевых клеток через геномную нестабильность и через эпигенетические изменения, что делает опухоль непредсказуемо разнообразной и трудно поддающейся лечению.

Также в эпителиальных клетках молочной железы человека активаторы EMT, например FoxC2, также могут придавать свойства стволовых клеток эпителиальным клеткам. А Lgr5 необходим для поддержания стволовых клеток рака груди и выявлена положительная корреляция между высокой экспрессией Lgr5 и более короткой выживаемостью пациентов.

Почти все колоректальные аденомы и карциномы человека обнаруживают генетические изменения в одном из компонентов пути Wnt, в основном APC с потерей функции или мутации, активирующие β-catenin (см. выше). При этом мутации APC приводят к переходу от асимметричного к симметричному делению ISCs. Интересно, что популяция клеток с высоким содержанием Wnt ответственна при CRC за метастазирование в отдаленные участки органов, такие как печень. Примером нацеливания на Wnt из (микро) окружающей среды могло бы быть блокирование рецептора MET и предотвращение активации происходящим из миофибробластов HGF.

СBCs расположены между клетками Панета, а позже были предложены как ISCs; сами клетки Панета обеспечивают нишу для ISCs, критически выделяя факторы, которые вносят вклад в состояние ISC, в частности лиганды Wnt. CBCs также экспрессируют Msi-1, который важен для передачи сигналов Notch путем ингибирования экспрессии репрессора Notch Numb. Только от пяти до семи ISC преимущественно участвуют в постоянной фиксации ниши.
Клетки CBC обнаруживают различия в экспрессии функциональных маркеров в зависимости от их расположения в пределах дна крипты и способны к двунаправленному преобразованию, для чего кажутся важными два фактора:
1) внутренняя способность переключать судьбу клетки, например, путем ремоделирования хроматина; при переходе от ISC к дифференцированному клеточному состоянию основные изменения происходят в сайтах доступности хроматина многих генов, специфичных для клеточного типа.
2) получение сигналов ниши для обратимого получения фенотипа и функциональности ISC. Даже терминально дифференцированные клетки Панета и энтероэндокринные клетки на поздних стадиях все еще обладают способностью переключаться обратно в состояние ISC, что указывает на то, что, вероятно, любая эпителиальная клетка кишечника обладает этим потенциалом.

Сорок процентов всех колоректальных карцином человека показывают активированный путь PI3K-Akt, в основном из-за инактивации PTEN. Более того, наследственные мутации PTEN (синдром Каудена) приводят к возникновению гамартоматозных полипов кишечника. Передача сигналов PI3K усиливает самообновление ISC, что может быть объяснено связью между передачей сигналов PI3K и путем Wnt: p-Akt может фосфорилировать β-catenin, главный эффектор канонического пути Wnt. PTEN экспрессируется в градиенте между криптой и просветом с наиболее сильной экспрессией в клетках просвета эпителия и, таким образом, может участвовать в ограничении передачи сигналов Wnt от основания крипты.

Костные морфогенетические белки (BMP) связываются с рецепторами BMP I или II типа (BMPR1 или BMPR2). Это приводит к фосфорилированию SMAD1, 5 или 8, которые затем образуют гетеродимер с SMAD4, перемещаются в ядро ​​и действуют как активаторы транскрипции. В кишечнике BMP4 секретируется межворсинчатыми стромальными клетками, а BMPR1 экспрессируется во всех эпителиальных клетках кишечника, способствуя их дифференциации. Ингибирование передачи сигналов BMP в эпителиальных клетках кишечника с помощью Gremlin активирует передачу сигналов Wnt. Более того, BMP стабилизирует PTEN, тем самым приводя к снижению активности Akt и последующему снижению накопления ядерного β-катенина.

Сразу после того, как клетки покидают богатую Wnt среду, в игру вступают такие сигнальные маршруты, как Notch, BMP и EGFR / MAPK. Активация Notch в клетках-предшественниках опосредуется паракринной передачей сигналов через секрецию лигандов Delta-like 1 (Dll1) и Dll4 и приводит к образованию абсорбирующего клона.
Передача сигналов Notch контролирует решения клеточной судьбы в развитии многих тканей, а регулируемое снижение передачи сигналов Notch в сотрудничестве с активацией специфических факторов bHLH, таких как Atoh1 и NeuroD, индуцирует специфическую дифференцировку в кишечные эпителиальные клоны. Были обнаружены различия клеточного цикла среди популяции стволовых клеток толстой кишки, из которых высокая экспрессия Notch и Lrig1 отмечает популяцию с медленным циклом.

[albert52]

Продолжим.

В среднем предполагается, что одна стволовая клетка толстой кишки будет заменяться в крипте каждый год. В гомеостазе постоянная стохастическая конкуренция имеет место между 5–7 функциональными ISC. Эта динамика соответствует модели «нейтрального дрейфа», что указывает на случайное замещающее поведение ISC на дне крипты. Однако, когда ISC приобретает онкогенную мутацию, например, в APC или Kras , возникает смещение в пользу мутантных клеток (biased-drift). Например, вероятность того, что мутантная клетка Kras G12D заменит свои соседние ISC и, наконец, станет клональной внутри крипты, составляет соответственно 60–70% по сравнению с 12,5–20% для немутантных ISC. Важно отметить, что хотя мутировавшие ISC получают более высокую вероятность фиксации ниши, эти клетки по-прежнему подверга -ются замене нормальными ISC. Интересно, мутации Trp53 присутствуют только в случае более высокой скорости фиксации ниши в случае колита, что еще раз подчеркивает важность внешних факторов в злокачественной трансформации кишечных клеток.

Морфогены Sonic hedgehog (Shh) и Indian hedgehog (Ihh) секретируются эпителиальными клетками, а их рецептор Patched (PTCH) экспрессируется в субэпителиальных миофибробластах. Следовательно, передача сигналов Hedgehog (HH) не участвует напрямую в судьбе эпителиальных клеток, но важна для построения правильной общей структуры крипт и ворсинок слизистой оболочки кишечника. Поэтому нарушение передачи сигналов HH также оказывает сильные вторичные эффекты на эпителиальные клетки кишечника. При этом передача сигналов Wnt усиливается, увеличивается пролиферация и в ворсинах образуются атипичные структуры крипт. Эти эффекты могут быть приписаны снижению экспрессии BMP стромальными клетками, которая обычно запускается HH. Более того, Ihh, подавляет экспрессию TCF4 и β-catenin и, таким образом, его паттерн экспрессии с макси -мумом на сайте просвета крипт в эпителии толстой кишки ограничивает передачу сигналов Wnt от основания крипт.

Упрощенный взгляд на нишу стволовых клеток, который может оказаться гораздо более сложным: предполагаемые перекрестные связи передачи сигналов, определяющие нишу стволовых клеток и нишу дифференцирующихся клеток. В верхних областях крипт Ihh запускает экспрессию BMP в стромальных клетках, что затем активирует экспрессию PTEN в эпителиальных клетках. Все три фактора прямо или косвенно ингибируют передачу сигналов Wnt, направляя клетки к дифференциальным клонам.
В самой нише стволовых клеток окружающие стромальные клетки секретируют ингибиторы BMP Noggin и Gremlin, что приводит к ослаблению репрессии передачи сигналов Wnt. Кроме того, строма обеспечивает лиганды Wnt для индукции передачи сигналов Wnt через рецепторы Fzd в стволовых клетках и транзитно-амплифицирующих клетках.

На ппродвинутой стадии аденомы эпителий обнаруживает большие области незрелого фенотипа, напоминающий ограниченную зону транзита-амплификации в нижних частях нормальных крипт и указывающий на рост популяции пролиферативных клеток. Более того, ядерный β-catenin все чаще обнаруживается на всем протяжении крипт и ассоциируется с повышенной дисплазией в аденомах человека.
Рак можно рассматривать, по крайней мере частично, как следствие нерегулируемого контроля стволовых клеток. Обоснование, подтверждающее происхождение опухолей кишечника стволовыми клетками:
1. В отличие от короткоживущих дифференцированных кишечных эпителиальных клеток, в этой высокооборотной ткани ISC являются долгоживущими, что позволяет накапливать критические генетические изменения.
2. При колоректальном раке наиболее частые, ограничивающие скорость мутации, такие как мутации, встречающиеся в гене APC, усиливают передачу сигналов Wnt, которая оказывается решающим регулятором ISC.
3. Типичные колоректальные аденокарциномы человека и соответствующие метастазы неоднородны и демонстрируют множество стадий дифференцировки в пределах отдельной опухоли, что соответствует происхождению стволовых клеток.
4. Концепция раковых стволовых клеток, первоначально разработанная для гематопоэтических неоплазий, становится общепринятой для солидных видов рака, включая колоректальный рак.

Как и нормальные стволовые клетки, CSC обладают мультилинейным потенциалом дифференцировки и дают начало иерархично организованной клеточной популяции. Увеличение популяции самих CSC осуществляется благодаря преобладанию их симметричного деления (приводящему к образованию 2 дочерних клеток) над ассимметричным (в результате которого образуется 1 дочерняя CSC и 1 дифференцированная клетка). CSC демонстрируют высокий уровень экспрессии белков, принадлежащих семейству мембранных ABC транспортеров, вовлеченных в обеспечение резистентности к химиотерапии (ХТ).

По аналогии с причинами возникновения CSC (или нормальная стволовая клетка, или нормальная дифференцированная клетка) существуют 2 возможные теории развития рака толстой кишки: «восходящая» и «нисходящая». Первая предполагает развитие КРР из стволовой клетки, находящейся в базальном отделе крипты, в результате аномальной дифференцировки в направлении CSC (см. выше). В пользу этой теории говорит идентификация специфических генов, характерных для кишечных стволовых клеток, в предшествующих аденомах.
Сторонники «нисходящей» теории руководствуются гистологическими проявлениями аденомы толстой кишки, такими как дисплазия/неоплазия эпителия и повышенная экспрессия Ki-67, наблюдаемыми в вершине ворсинок при интактных клетках базальных отделов. Маркер Ki-67 свидетельствует об интенсивности пролиферативных процессов; отмечу только, что гипотеза о нисходящем развитии рака из-за высокого индекса клеточного деления вроде бы дифференцированных клеток на верхушках крипт легко обьясняется моей теорией: высокий уровень экспрессии классического гена инфраструктуры Мус в таких клетках заставляет их накапливать клеточную массу и делиться, хотя необходимости в этом нет.
Биосинтетические процессы в дифференцированных клетках (на стадии G0) вообще не интенсивны: нормально работающие станки нет необходимости менять. Таким образом при сверхэкспрессии Мус накапливаются преимущественно стройматериалы для последующего деления, а не специализированные белки клеток.

Одним из ключевых медиаторов, обеспечивающих трансформацию ISC, является антиапоптотический белок BCL-2, который одновременно высоко экспрессируется в Lgr5 + CBC и является геном-мишенью пути Nf-κB. Более того, учитывая способность кишечных эпителиальных клеток к пластичности во время повреждения и регенерации тканей, кажется вероятным, что воспалительные сигналы из окружающей среды придают дифференцированным клеткам такой же онкогенный потенциал, как и у клеток ISC.

Обычно считается, что активация воспалительного пути ядерного фактора NF-κB приводит к про-онкогенному воспалительному микроокружению. А комплекс IκB-киназы (IKKα и IKKβ) и его регуляторная субъединица (IKKγ) регулируют передачу сигналов NF-κB, при этом ядерная IκB-киназа α (IKKα) может напрямую связываться с промоторами факторов воспаления и Lgr5, что, в свою очередь, усиливает экспрессию Lgr5, в том числе за счет активации сигнального пути STAT3 во время прогрессирования, например, базальноклеточной карциномы.
Sox2 играет ключевую роль в поддержании стволовых клеток, детерминации их гибели и является необходимым фактором для репрограммирования соматических клеток по пути плюрипотентности. Sox2 участвует в развитии большого количества типов злокачественных новообразований и является маркером CSC. Для рака пищевода и легкого наличие Sox2 служит прогностическим маркером. Реакция Sox2 в норме имеет ядерную локализацию.

В нормальной слизистой оболочке толстой кишки экспрессия Sox2 чаще всего отсутствует. Вообще-то Sox2 играет большую роль в развитии верхнего, но не нижнего отдела пищеварительного тракта. Sox2 уменьшает экспрессию Е-кадгерина на плазматической мембране, что приводит к снижению связывающей способности адгезивного комплекса к β-катенину. Подавление транскрипции Sox2 приводит к ингибированию Wnt-сигнального пути у пациентов с КРР (раком ирлстой кишки).
Подавление транскрипции Sox2 приводит к достоверному снижению активности белка MMP2 и, как следствие, уменьшению клеточной миграции и подвижности. У больных раком толстой кишки с сильной реакцией Sox2 процент метастазов в печень и регионарные лимфатические узлы (ЛУ) был вдвое выше, чем у пациентов с отрицательной реакцией Sox2.