Очерк натуральной онкологии

[albert52]

Вернемся к раку толстой кишки.

Морфологическая структура ткани кишечника предотвращает быстрое распространение мутировавших клеток, поскольку каждая из этих крипт сама по себе является динамической клеточной нишей без какого-либо обмена клетками между криптами. Однако количество крипт нестабильно из-за двух процессов, называемых делением и синтезом, что означает раздвоение и столкновение крипт соответственно. Эти противодействующие процессы компенсируют друг друга и случаются нечасто, если не происходит повреждение тканей.

В криптах с мутацией Kras наблюдается гораздо более высокая скорость деления. Множественные KRAS мутированные соседние крипты могут окружать CRC, предполагая , что в пределах области KRAS мутантных крипт одна крипта подверглась дальнейшей трансформации. Таким образом, деление крипт, по-видимому, является важным механизмом злокачественной трансформации и прогрессирования в кишечнике, включая процесс, называемый полевой канцеризацией. Она представляет собой замену популяции нормальных клеток популяцией клеток, примированных к раку, которая может не демонстрировать морфологических изменений.

Как только аденома образуется при разрастании мутировавших крипт и имеет размер не менее 1 см, существует ~ 25% риск того, что эта новообразованная аденома подвергнется в следующие два десятилетия злокачественной трансформации в инвазивную карциному. В аденоматозных криптах присутствует ~ 9 функциональных опухолевых стволовых клеток на сотни клеток в каждой железе. Это контрастирует с процентом клеток Lgr5 +, который обнаруживается в аденомах, примерно ~ 20% от общей популяции (~ 400 клеток на железу), то есть только часть стволовых клеток аденомы являются ОСК.
В случае аденом человека была также продемонстрирована множественная дифференцировка в пределах железистых структур, что предполагает существование мультипотентных стволовых клеток. Уже на ранней стадии туморогенеза также возникает интрааденомное эпигенетическое клональное разнообразие.

Во время роста CRC продемонстрирована явная гетерогенность в динамике роста пула раковых клеток в различных областях опухоли, например, в клетках, расположенных рядом с границей или ближе к центру. Примечательно, что клоногенный рост происходит в основном на границе опухоли, а не в центре опухоли, то есть размножаются в основном окислительные опухолевые клетки, как я уже упоминал, предпочтительно использующие лактат для получения энергии.

В дополнение к сигнатурным мутациям APC, TP53 и KRAS, углубленное геномное и транскриптомное профилирование выявило гетерогенность заболевания, отражаемую многочисленными низкочастотными мутациями и профилями транскрипции, классифицированными по четырем консенсусным молекулярным подтипам (CMS) :
* CMS1 (, 14%), характеризуется гипермутацией, MSI и активным иммунным ответом.
* СMS2 ((канонический, 37%), эпителиальный, хромосомно нестабильный, с заметной активацией передачи сигналов WNT и MYC;
* CMS3 (метаболический, 13%), эпителиальный, очевидная метаболическая дисрегуляция;
* CMS4 (мезенхимальный, 23%), заметная активация TGF-β, стромальная инвазия и ангиогенез.
Образцы со смешанными признаками (13%), возможно, представляют собой переходный фенотип или внутриопухолевую гетерогенность. МУС наиболее выражен в подтипах CMS3 и 4, хотя и в остальных подтипах тоже достаточно активен (всего в 70% CRC).

В целом можно сказать,что CMS1 содержит в основном микросателлитные нестабильные (MSI) опухоли с гипермутацией/гиперметилированием и сильной иммунной активацией. CMS2 представляет собой CIN, а также усиление передачи сигналов WNT и MYC. CMS3 обогащен мутациями KRAS и метаболически сверхактивирован. CMS4 определяется активацией пути TGF-бета, эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) и ангиогенезом.

Отмечены общие черты между GC и CRC, включающие специализированные типы клеток в исходной ткани (стволовые клетки LGR5, бокаловидные клетки и клетки сенсорного пучка), потеря опухолевого супрессора APC, активация передачи сигналов WNT и активация TGF-beta/ EMT. Также CMS4 является наиболее распространенным типом в GC, за ним следуют CMS1, CMS3 и CMS2. CMS4 тесно связан с подавлением семейства ингибиторов ЕМТ miR-200 и последующей активацией ЕМТ.
Примечательно, что CMS4 имеет сильную контингентность с подтипом ACRG EMT, а CMS1 имеет сильную контингентность для микросателлитных нестабильных подтипов во всех трех системах классификации рака желудка.

Классификация CMS обеспечивает основу для прогнозирования и улучшения назначения таргетной терапии в прецизионных исследованиях.

Теперь подробнее о CMS классификации. Опухоли CMS1 часто диагностировались у женщин с правосторонними поражениями и имели более высокую гистопатологическую степень, а также демонстрируют высокий статус гиперметилирования островков CpG; при локализации опухоли в прямой кишке только в 0,1% наблюдений определялся CMS1 подтип. Напротив, опухоли CMS2 были в основном левосторонними и имеют более частое увеличение числа копий в онкогенах и потерю генов-супрессоров опухолей, чем в других подтипах.

Опухоли CMS4, как правило, диагностировались на более поздних стадиях (III и IV) и демонстрировали более высокую хромосомную нестабильность (CIN), измеренную по количеству SCNA (изменению числа соматических копий хромосом или их частей). Также обнаружена лучшая выживаемость после рецидива у пациентов с CMS2. Интересно, что популяция CMS1 имела очень плохую выживаемость после рецидива, что согласуется с недавними исследованиями, показывающими худший прогноз у пациентов с MSI и рецидивирующей CRC с мутацией BRAF.

CMS1 характеризуется повышенной экспрессией генов, связанных с диффузным иммунным инфильтратом, в основном состоящим из TH1 и цитотоксических Т-клеток, наряду с сильной активацией путей уклонения от иммунной реакции. Отмечена высокая экспрессия хеммоатрактантов к Т-лимфоцитам (CXCL9, CXCL10 и CXCL16) или молекул, участвующих в формировании третичных лимфоидных структур (CXCL13), повышенная экспрессия INFγ и IL15, высокая экспрессия генов, кодирующих PD-1 лиганды. Интересно, что последние также выявлены и при мезенхимальном подтипе.
MSI oпухоли могут встречаться при разных подтипах, однако, если они ассоциированы с CMS1 подтипом, то обладают более высокой иммуногенностью за счет большого количества неоантигенов.

При каноническом (CMS2) же подтипе снижена презентация белков главного комплекса гистосовместимости I класса, низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами. Индекс пролиферации опухолевых клеток был связан с успешным установлением PDX (patient-derived xenograft), что позволило выделить пациентов с плохими клиническими исходами в рамках CMS2. Отмечу, что модели PDX (ксенотрансплантаты, полученные от пациента) используются для создания среды, которая обеспечивает естественный рост рака, его мониторинг и соответствующие оценки лечения пациента.

[albert52]

Вставка.

Микросателлитная нестабильность (MSI)

Дефект восстановления несоответствия (MIS-match reh-PAYR deh-FIH-shun-see) описывает клетки, имеющие мутации (изменения) в определенных генах, участвующих в исправлении ошибок, допущенных при копировании ДНК в клетке. Клетки с дефицитом репарации несоответствия (MMR) обычно имеют много мутаций ДНК, которые могут привести к раку.

Приобретение геномной нестабильности является одной из ключевых характеристик раковой клетки, а микросателлитная нестабильность (MSI) является важным сегментом этого явления. Неисправность пути восстановления MMR увеличивает мутационное бремя конкретных видов рака и часто участвует в его этиологии, иногда в качестве влиятельного свидетеля, а иногда в качестве основной движущей силы.

Чертежи конкретных опухолей MSI полезны для точной классификации, оценки вероятности рака и прогноза, чтобы помочь нам понять, как и почему возникают устойчивые к терапии раковые образования. Кроме того, данные показывают, что MSI является важным прогностическим биомаркером для применения иммунотерапии.

Совокупность наблюдаемых генетических изменений при раке часто называют «ландшафтами генома рака». Система восстановления несоответствия (MMR) отвечает за поддержание стабильности генома. Когда MMR не функционирует нормально, происходят изменения микросателлитов, и общая скорость мутаций данной клетки увеличивается.
MMR - это клеточный пострепликационный процесс, который сохраняет гомеостаз ДНК и как таковой является эволюционной гарантией стабильности генома. Основная задача системы репарации ошибочного спаривания ДНК состоит в том, чтобы исправить спонтанные неправильные пары основание-основание и небольшие петли вставок-делеций (инсерции), которые в основном образуются во время репликации ДНК.

Полимеразы, которые запускают синтез ДНК в репликационных вилках, работают не без ошибок. Частота ошибок, совершаемых эукариотическими ДНК-полимеразами, оценивается примерно в одну ошибку на каждые 10 5 нуклеотидов, что означает, что ~ 100000 ошибок происходит во время каждой клеточной S-фазы. Первая линия защиты от такой высокой частоты мутаций - это корректирующая активность ферментов полимеразы. Хотя ДНК-полимеразы обеспечивают такую ​​лекторирующую активность своими собственными доменами, некоторые внесенные мутации все еще могут проскальзывать незаметно, и их необходимо корректировать с помощью второй линии защиты - экспрессии генов, связанных с MMR.
Механизмы MMR включают следующие этапы: распознавание повреждений, инициирование восстановления, удаление повреждений и ресинтез ДНК (см. выше). У человека механизм MMR имеет 8 генов, кодирующих его компоненты; при этом вариации дефицита генов репарации ДНК важны для специфической восприимчивости опухоли.

Продукт гена hMSH2, расположенный на хромосоме 2p21, является основным корректирующим белком MSH. Чтобы исправить ошибочно спаренные основания, он создает два разных гетеродимера - один с MSH6, а другой с MSH3. Поскольку было показано, что MSH6 экспрессируется в 10 раз больше, чем MSH3, в клетках человека преобладает первый гетеродимер. Гетеродимеры MSH2-MSH6 и MSH2-MSH3 связываются с несовпадениями при проверке постреплицированной цепи ДНК, которая инициирует репарацию ДНК. Образованные комплексы MSH превращаются в скользящие зажимы на спирали ДНК. Они скользят до тех пор, пока не будут обнаружены неправильные пары оснований и другие дополнительные спиральные поражения. ПРи этом скользящий зажим MSH2-MSH6 может отделять нуклеосому от ДНК, если присутствует несоответствие, и что эта диссоциация усиливается ацетилированием H3.

Гетеродимеры MSH2-MSH6 обнаруживают несоответствия единичных оснований и искажения в виде вставок-делеций динуклеотидов, тогда как MSH2-MSH3 идентифицируют более крупные петли вставки-делеции длиной ~ 13 нуклеотидов. Их последующее присоединение к комплексам MLH1 / PMS2 приводит к деградации мутированного фрагмента последовательности ДНК и возобновлению синтеза.

После распознавания несовпадений ДНК и связывания первого гетеродимера другие молекулы, такие как ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), фактор репликации C (RFC), MutLα (гетеродимер MLH1-PMS2) и экзонуклеаза 1 (Exo1), привлекаются в комплекс, приводящий к окончательной диссоциации несоответствия.

Белки MMR вместе с ДНК претерпевают повторяющиеся конформационные изменения. Было продемонстрировано, что после обнаружения несоответствия гетеродимер MSH2-MSH3 изгибает спираль ДНК и что это конформационное изменение делает возможным правильную репарацию. Заболевания, связанные с аберрациями гена MSH3 , включают рак толстой кишки, мочевого пузыря и эндометрия.

hMSH5 расположен на 6p21.3, ассоциируется исключительно с MSH4 и действует во время мейоза в событиях кроссинговера и конверсиях генов. Было обнаружено, что гетеродимеры MSH4-MSH5 специфически и в большом количестве присутствуют в репродуктивных тканях млекопитающих, поскольку их основная роль заключается в мейотической рекомбинации. Он участвует в репарации двухцепочечных разрывов, ответе на повреждение ДНК и разнообразии иммуноглобулинов, а его SNP ( Single Nucleotide Polymorphism) локусы связаны со многими различными заболеваниями человека, включая рак.
Нарушения MLH3 проявляются в нестабильности длины коротких повторяющихся последовательностей и соматические мутации MLH3 часто обнаруживаются в опухолях, подверженных микросателлитной нестабильности. Заболевания, связанные с изменениями MLH3, включают рак толстой и прямой кишки, эндометрия и глиому низкой степени злокачественности.

Связывание и гидролиз АТФ жизненно важны для регуляции MMR. Когда обнаруживается несоответствие G / T, комплекс MSH2-MSH6 обменивает АДФ на АТФ, таким образом функционируя как молекулярный переключатель. Высококонсервативная область находится в гене MSH6 и координирует связывание и гидролиз АТФ.

[albert52]

Продолжим.

Микросателлиты помимо кодирующих областей генов также менее распространены в эволюционно консервативных геномных областях, таких как CpG-островки и сайты связывания факторов транскрипции и более стабильны. Возникновение MSI может серьезно повлиять на фенотип из-за нарушений или потери функции белка. Так, предположено, что частота микросателлитов в кодирующих областях минимизирована давлением отбора против мутаций рамки считывания, а некодирующие области, такие как интроны, внутригенные области и сайты сплайсинга, имеют значительно больше микросателлитов. При этом микросателлитные локусы в интронах и других нетранслируемых областях играют роль в модуляции экспрессии генов, влияя на транскрипцию и сплайсинг генов.
Общая точка зрения на наследование частоты MSI состоит в том, что длина повторов и состав микросателлитов в определенных локусах пропорциональны их частотам.

Oбщее количество митозов, которые стволовые клетки осуществляют в определенной ткани, положительно коррелирует с пожизненным риском развития рака. При этом количество мутаций, обнаруженных в каждой опухоли, сильно отличается не только от количества, обнаруженного в нормальных клетках, но и между различными типами опухолей, в диапазоне от 500 до 100000 мутаций.

Поскольку они отвечают за коррекцию мутационной перегрузки, гены MMR приобрели роль генов-супрессоров опухолей. При спорадических ненаследственных формах рака MSI является следствием либо инактивирующих мутаций в одном из генов MMR, либо эпигенетических механизмов репрессии гена MMR, включая подавление регуляции микроРНК. Сравнительное исследование miRNAs, участвующих в колоректальном раке, показало, что снижение уровней miR-552, miR-592, miR-181c и miR-196b наблюдалось в опухолях с развитой MMR по сравнению с повышенными уровнями miR-625 и miR-31 в опухоли с дефицитом MMR.

Неисправность белков MMR из-за мутации или снижения экспрессии предполагает корреляцию развития рака с аберрациями всех или большинства белков MMR. MSI-H: 31,37% карциномы тела матки эндометрия, 19,72% аденокарциномы толстой кишки; 19,09% аденокарциномы желудка, 5,73% аденокарциномы прямой кишки.
В случае колоректального рака дефицит MMR может возникать как совершенно спорадический процесс из-за аберрантного гиперметилирования MLH1 в опухоли, обычно связанного с мутацией BRAF V600E. Дефицит MMR чаще всего проявляется как спорадический (ненаследственный) процесс, характеризующийся отчетливой гиперпролиферативной, зубчатой ​​морфологией, аномалиями метилирования ДНК, включая CIMP, и повышенной частотой активирующих мутаций BRAF.

Основная специфичность опухолей MSI-H - увеличение количества микросателлитных аллелей вместе с общим количеством нестабильных микросателлитных локусов. Пациенты, которым отнесено более высокое общее бремя MSI и которым поставлен диагноз MSI-H, демонстрируют тенденцию к более длительной выживаемости. Это можно объяснить иммунотерапевтическим ответом, который происходит при раке с повышенной частотой мутаций. Раковые клетки, которые часто встречаются в общем потенциале MSI, транслируют большее количество мутировавших и усеченных белков всех видов, что приводит к пробуждению иммунной системы, которая замедляет прогрессирование опухоли. Кстати, поэтому удаление первичной опухоли может создать благоприятные условия для развития метастазов в менее иммуногенной метастатической нише (см. выше).
Дефектный MMR (dMMR) в сочетании с MSI стал важным биомаркером, который может помочь в решении, является ли конкретный тип рака хорошим кандидатом для иммунотерапии контрольных точек.

При раке насчитывают от 87 до 9032 нестабильных микросателлитов, причем среднее количество нестабильных микросателлитных локусов значительно варьирует. Рак толстой кишки показывает самое большое количество локусов MSI. Нестабильные микросателлиты обнаруживаются внутри или в непосредственной близости от генов, уже известных своим онкогенным потенциалом. Таким образом, нестабильные микросателлиты могут быть полезны для распознавания новых генов-кандидатов, вызывающих рак.
Кроме того, профили MSI по отдельным микросателлитным локусам помогают их группировать. Так, присутствие MSI в опухолях астроцитом с использованием полиморфных микросателлитных маркеров для генов DVL показало, что MSI присутствует в 28,6% пилоцитарных, 61,5% диффузных, 45,5% анапластических астроцитом и в 34,3% глиобластом, что еще раз демонстрирует относительно постоянное присутствие MSI на разных степенях астроцитом.

Ранние колоректальные аденомы демонстрируют маркеры иммунореактивности даже при отсутствии высокой соматической мутации или неоантигенной нагрузки. По мере прогрессирования поражений до прогрессирующих аденом и карцином наблюдается соответствующий рост количества мутаций/ неоантигенов и маркеров иммунной толерантности.
Опухоли с дефицитом MMR часто демонстрируют высокую мутационную нагрузку и могут экспрессировать неоантигены, генерируемые мутациями сдвига рамки считывания в кодирующих микросателлитах. Неоантигены будут вызывать активное иммунное микроокружение и повышать иммуногенность опухоли.

Инфильтрирующих лимфоцитов больше при колоректальном раке с дефицитом MMR, сопровождающимся сверхэкспрессией воспалительных цитокинов. Более того, было продемонстрировано, что несколько контрольных точек, включая PD-L1 и CTLA4, были активированы при колоректальном раке. Универсальный биомаркер - мутационная нагрузка опухоли (TMB) оказался полезным для прогнозирования ответа на иммунотерапию на различные типы применяемых иммунотерапевтических средств. Высокая нагрузку опухолевых мутаций (TMB) обычно определяется как более 10 мутаций на мегабазу (Mb).

Каждая стратегия лечения нуждается в целенаправленном пересмотре рисков и преимуществ. Например, хотя антитела анти-PD-1/PD-L1 могут усилить иммунный надзор, они также связаны со значительной частотой тяжелых нежелательных явлений. К ним относятся иммуноопосредованные легочные, печеночные, кожные, неврологические, желудочно-кишечные и эндокринные токсические эффекты, некоторые из которых приводят к летальному исходу. Ингибиторы PD-1/PD-L1 также не имеют четкой реакции на дозу, что делает проблематичным назначение более низких доз этих препаратов для профилактики рака.

При синдроме Линча распространенность предраковых состояний (особенно аденом) зависит от возраста и генной мутации и кол***ется от 10,6% до 33%, но только около 50% этих аденом демонстрируют дефицит MMR, остальные связаны с CIN. Напротив, у ниъ гистологически нормальные крипты с дефицитом MMR относительно многочисленны в слизистой оболочке здоровых пациентов, что означает, что значительное количество MMR-дефицитных крипт подвергается «иммуноредактированию» до трансформации в аденомы.
Иммуноредактирование — это процесс, при котором аномальный рост клеток останавливается и регрессирует с помощью Т-клеточного иммунитета. В случаях, когда поражение не полностью искоренено, за иммуноредактированием следуют фазы равновесия и, в конечном итоге, фазы ускользания от иммунного ответа, когда оставшиеся клетки способны уклоняться от обнаружения иммунной системой.

Кстати, у пациентов с синдромом Линча нестабильность кодирующих и некодирующих микросателлитов дает надежную сигнатуру неоантигенов, специфичных для опухоли/ткани, на которые могут быть нацелены предварительно разработанные библиотеки вакцин. Сейчас ранняя фаза клинических испытаний с использованием пептидов, идентифицированных как иммуногенные.

[albert52]

Вставка.

Опухолевые почки (Tumor budding)

Значительное количество опухолей ведет себя агрессивно, несмотря на то, что они относятся к категории низкого риска на основании их стадии TNM. Таким образом, необходим поиск дополнительных прогностических факторов при оценке колоректальной карциномы. Из изученных на сегодняшний день гистопатологических факторов наиболее многообещающими являются экстрамуральная венозная инвазия, характер наступающего фронта (выталкивающий или инфильтративный), воспалительный инфильтрат, микросателлитная нестабильность и почкование опухоли — наличие небольших дискретных скоплений опухолевых клеток в инвазивном краю.

Опухолевые почки, определяемые как наличие одиночных опухолевых клеток или небольших скоплений до пяти опухолевых клеток на перитуморальном инвазивном фронте (перитуморальные почки) или внутри основного тела опухоли (внутриопухолевые почки), представляют собой гистоморфологический коррелят раковых клеток, подвергшихся ЕМТ.
Почкующиеся гнезда часто обнаруживаются рядом с областями инвазии лимфоваскулярного пространства, причем ряд «зачатков» на инвазивном крае опухоли фактически расположен в небольших лимфатических пространствах. Наличие почкования также связано с повышенным риском отдаленных метастазов. При подслизисто-инвазивной колоректальной карциноме высокая степень злокачественности опухоли, лимфоваскулярная инвазия и почкование опухоли являются тремя факторами, независимо связанными с метастазами в лимфатические узлы.
У пациентов без какого-либо из этих трех признаков была исключительно низкая частота метастазов в лимфатические узлы (1%); при наличии одного фактора риска частота узловых метастазов существенно увеличивалась до 21%, а при наличии двух или трех факторов риск составлял 36%.

Что касается категорий CRCSC, клетки ТБ показали профиль экспрессии генов, соответствующий «мезенхимальному фенотипу» (CMS4), также клетки в основной опухоли чаще всего имели связь с фенотипом CMS2 — большее количество опухолевых зачатков было обнаружено в опухолях CMS4, чем в опухолях CMS2 и CMS3 — и мутациями KRAS. ТБ-клетки у пациентов с CRC также демонстрируют повышенную экспрессию ZEB1 и сопутствующее снижение miR-200b и miR-200c, что подтверждает связь между членами семейства miR-200 и ЕМТ.

Поскольку у пациентов с колоректальной карциномой II стадии исходы сильно различаются, почкование опухоли может быть особенно полезным для выявления подгрупп высокого риска в этой популяции. Наличие почкования опухоли предсказывает плохой ответ на анти-EGFR-терапию у пациентов с метастатической колоректальной карциномой.

Сильное почкование опухоли тесно связано с опухолями, возникающими из опухолей с мутацией гена APC в отличие от микросателлитной нестабильности. В спорадических микросателлитных стабильных и низкочастотных микросателлитных нестабильных опухолях частота отпочковывания опухоли составляла примерно 50%, причем почкование опухоли практически отсутствует при спорадической высокочастотной микросателлитной нестабильной карциноме, что может, по крайней мере частично, объяснить относительно лучший прогноз.

Белки, участвующие в деградации внеклеточного матрикса, такие как MMP-9 и катепсин B, сверхэкспрессируются в опухолевых почках; экспрессируется также белок клеточной локомоции ламинин 5γ2. Другие белки клеточной адгезии, такие как EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), вовлечены в процесс почкования с потерей мембранной экспрессии; EpCAM активируется путем протеолиза, что приводит к высвобождению EpICD в цитоплазму, которая становится частью транскрипционного комплекса ß-catenin и LEF. Он обладает онкогенным потенциалом благодаря своей способности активировать c-myc, e-fabp и циклины A и E.

Молекула адгезии нейрональных клеток L1 также была идентифицирована как ген-мишень β-катенина и преимущественно экспрессируется в опухолевых зачатках, где она совместно регулируется с ADAM10, металлопротеазой, участвующей в отщеплении внеклеточного домена L1s; L1 индуцирует передачу сигналов NF-κB в клетках колоректального рака, при этом NF-κB участвует в EMT.

Маркер стволовости CD133 преимущественно экспрессируется на переднем фронте инвазивной опухоли, но не внутри самих опухолевых зачатков. Вообще, экспрессия CD133, CD44 и CD90 является редким событием в опухолевых зачатках, что свидетельствует о том, что опухолевые клетки в зачатках подвергаются дифференцировке в мезенхимальный фенотип.
Что же касается экспрессии Lgr5, то обнаружено, что небольшое подмножество зачатков является положительным для этого предполагаемого продуцента стволовых клеток, но в отдаленных метастазах была обнаружена в 6-11,5 раз более высокая степень экспрессии.

В целом считается, что опухолевые клетки, происходящие из ЕМТ, являются гипопролиферативными. В самом деле, опухолевые зачатки демонстрируют цитоплазматическую экспрессию p16. В нормальных условиях ядерный p16 является прямым ингибитором циклина D1, останавливая клеточный цикл, однако считается, что расположенный в цитоплазме р16 связывается с CDK4, блокируя его транспорт в ядро. CDK4 необходим для активации циклина D1, следовательно, в отсутствие CDK4 циклин D1 образует неактивный комплекс с CDK2, что объясняет явно парадоксальную ко-активацию p16 и циклина D1.
В дополнение к их гипопролиферативному состоянию опухолевые зачатки обладают антиапоптотическим действием благодаря относительному отсутствию их реактивности в отношении каспазы 3, что позволяет предположить, что опухолевые зачатки способны противостоять аноикису.

Ген-супрессор опухоли RKIP был связан с EMT на нескольких уровнях, например, как ингибитор сигнального каскада Ras-Raf-MEK-ERK на уровне Raf. Кроме того, RKIP модулирует другие сигнальные пути, включая NFκB-Snail. Отмечена дифференциальную экспрессию RKIP в зонах колоректального рака с постепенной потерей экспрессии по направлению к фронту опухоли.

Нейротрофический тирозинкиназный рецептор TrkB был связан с EMT посредством RAS/MAPK-зависимой передачи сигналов Twist-Snail, и было продемонстрировано, что он является мощным и специфическим супрессором аноикиса, что подтверждается его сверхэкспрессией в опухолевых зачатках. Кроме того, колоректальный рак с мутациями KRAS также сверхэкспрессирует TrkB, что согласуется с известной зависимостью передачи сигналов MAPK от TrkB-индуцированной EMT.
Хемокин CXCL12 связывается со своим рецептором CXCR4, активируя последующие внутриклеточные пути, участвующие в хемотаксисе, выживании клеток и транскрипции генов. Поскольку CXCR4 экспрессируется в клетках многих органов, включая лимфатические узлы, легкие и печень, эпителиальные опухолевые клетки могут использовать принцип самонаведения для направления метастазов CXCL12-положительных опухолевых клеток в CXCR4-положительные органы. CXCL12 также может стимулировать образование капиллярных структур. Было обнаружено, что экспрессия CXCL12 в опухолевых зачатках коррелирует с метастазами в печень и является независимым прогностическим маркером.

Сигналы, происходящие от окружающих мезенхимальных клеток в микроокружении опухоли, могут играть важную роль в фиксации пропочковавшегося фенотипа. Так TWIST1, известный активатор ЕМТ, экспрессируется в опухолевых стромальных клетках; эти клетки демонстрируюи те же неопластические аберрации, что и сама опухоль.

[albert52]

Рак поджелудочной железы (PDAC)

Рак поджелудочной железы (РПЖ) — злокачественное новообразование, исходящее из эпителия железистой ткани или протоков поджелудочной железы. Обычно опухоль поражает головку железы (50-60 % случаев), тело (10 %), хвост (5-8 % случаев). Также наблюдается полное поражение поджелудочной железы — 20-35 % случаев. Для РПЖ с начала появления клинических симптомов характерно быстрое и агрессивное течение. Сами симптомы часто не специфичны и не выражены, поэтому на момент постановки диагноза менее 20% злокачественных опухолей поджелудочной железы являются операбельными.
Если опухоль поражает головку железы, то для дифференциации появляющейся желтухи используют синдром Курвуазье: при пальпации правого верхнего квадранта живота обнаруживается желчный пузырь, увеличенный вследствие давления желчи.

Рак поражает преимущественно людей пожилого возраста, одинаково часто мужчин и женщин. Факторами риска рака поджелудочной железы являются употр***ение спиртных напитков, курение (считают, что до 25—33% случаев рака ПЖ связано с курением), обилие жирной и острой пищи, избыточное употр***ение в пищу, особенно в жареном и копченом виде, животных жиров и мясных продуктов, которые содержат канцерогены (тетрациклические амины и полициклические ароматические гидрокарбоны), сахарный диабет и цирроз печени. К предраковым заболеваниям относятся аденома и киста поджелудочной железы, а также хронический панкреатит.

При хроническом панкреатите (ХП) наблюдается значительная извитость и расширение протоков с ретенционными кистами. Значительная структурная перестройка протоковой системы ПЖ у больных ХП наблюдалась в 87,5 % случаев, в 17,5 % случаев картина дополнялась явлениями ацинарно-протоковой метаплазии с трансформацией ацинарных клеток в протоковые и формированием мелких дуктулоподобных структур, так называемых тубулярных комплексов.
В дальнейшем это приводит к образованию белковых пробок и панкреатический секрет инфильтрирует окружающую ткань с формированием отека железы, за которым следует интрапанкреатическая активация пищеварительных ферментов с угрозой панкреонекроза. В 87,5 % случаев ХП паренхима ПЖ, таким образом, представляла собой небольшие атрофичные ацинусы, окруженные плотными фиброзными муфтами, с увеличенным количеством зияющих протоков разного диаметра.

В протоковой аденокарциноме к этому присоединяются клеточный атипизм прежде всего клеток мелких интеркалированных протоков, а также тканевой атипизм с высокой степенью извитости мелких протоков, часто тупиковых (см. ниже). Пациенты с хроническим панкреатитом более 5 лет имеют более чем 14-кратный риск развития рака поджелудочной железы по сравнению с общей популяцией.

Значительным прогрессом в диагностике рака поджелудочной железы на ранней стадии является эндосонография (эндоскопический ультразвук). В отличие от обычного УЗИ, для эндосонографии используется гибкий эндоскоп с видеокамерой и ультразвуковым датчиком, который можно ввести в кишку непосредственно к исследуемому образованию. При раке поджелудочной железы эндоскопический ультразвук позволяет установить диагноз в 90—95% случаев на самой ранней стадии. ТИАБ ( тонкоигольная аспирационная биопсия) позволяет выявить опухолевые клетки лишь у 80 % больных РПЖ.

Предложено применение в качестве скрининг‑теста РПЖ определение уровня опухолевых маркеров (ОМ). Достаточно информативным и хорошо изученным является ОМ СА 19‑9, уровень которого при РПЖ, как правило, превышает 100 Е/мл, тогда как при ХП такой уровень наблюдается крайне редко. Но его уровень бывает нормальным на ранних стадиях РПЖ, так как СА 19‑9 и многие другие ОМ – белки эктодермального происхождения, образующиеся у людей, эритроциты которых содержат Lewis‑антиген.
Повышение уровня СЕА (канцерэмбрионального антигена) при РПЖ чаще всего свидетельствует о метастатическом поражении печени. Пациенты, у которых уровень СЕА больше 15 нг/мл, имеют достоверно меньшую выживаемость.

Опухоль представляет собой плотный бугристый узел без чётких границ, на разрезе — белый или светло-жёлтый. Крупные опухоли, как правило, обнаруживаются в хвосте железы, в левом подреберье и при пальпации ошибочно принимаются за увеличенную селезенку. У одной четверти больных присутствуют, кроме основного очага, участки с карциномой in situ. Таким образом, возможно полифокальное возникновение очагов озлокачествления.

Всего насчитывают 5 гистологических форм РПЖ, но наиболее распространена аденокарцинома, наблюдающаяся в 80 % случаев рака поджелудочной железы. Чаще всего она исходит из эпителия выводных протоков. Вокруг опухоли желези*стые элементы подвергаются резкой атрофии, выводные прото*ки расширены, а окружающая их ткань склерозирована.

Выявлены три основных предшественника инвазивной аденокарциномы поджелу дочной железы : интраэпителиальная неоплазия поджелудочной железы (PanIN), IPMN (Intraduktal Papillär Muzinöse Neoplasien) и муцинозно-кистозное новообразование (MCN). PanIN является наиболее распространенным типом предшественников опухоли, возникающих из эпителиальных клеток протоков. Предполагается, что эти поражения проходят путь прогрессирования от интраэпителиальной протоковой гиперплазии (PanIN-1) через умеренную дисплазию (PanIN-2) до дисплазии высокой степени (карцинома in situ) и инвазивной карциномы .
По мере увеличения протоковой атипии увеличивается частота генетических изменений; в зрелой опухоли их в среднем около 60.
Хотя IPMN и MCN ответственны только за меньшую часть случаев рака поджелудочной железы (менее 15%), они дают возможность идентифицировать предраковые поражения поджелудочной железы, особенно с увеличением использования неинвазивных процедур визуализации брюшной полости высокого разрешения .

При спорадическом раке в среднем считают 11-12 лет от исходного события, начавшего канцерогенез поджелудочной железы, до развития ракового родительского клона и еще 6,8 года до развития метастатических субклонов в первичном раке, при этом пациенты умирают в среднем 2,7 года спустя. Пациент с первичной опухолью диаметром 1 см имеет вероятность возникновения метастазов на момент постановки диагноза 28%; когда основной размер увеличивается до 2 и 3 см, риск скрытых метастазов возрастает до 73 и 94% соответственно. Средний размер опухоли на момент обнаружения — 5 см. Средняя выживаемость— 16 нед от момента установления диагноза; 1 год живут 17% больных, 5 лет — 1%. Более 70% пациентов не реагируют на текущую терапию и, что еще хуже, неудача химиотерапии первой линии приводит к ускорению роста опухоли, способствуя резистентносим и метастазам.
Считается, что протоковый РПЖ, наиболее частый подтип, станет к 2030 году второй связанной с раком причиной смерти после рака легких . Высокая смертность из-за раннего распространения и устойчивости к радио- и химиотерапии. Три дополнительных фактора - обильные реакции стромы, преимущественное распространение по интрапанкреатическим нервам и выраженное иммунное отклонение.

Особенностью РПЖ является выраженный склероз как самой ткани опухоли еще на стадии рак in situ, так и вокруг опухоли, образуя как бы защитный вал. Это обьясняется тем, что на стадии тканевого атипизма вновь образующиеся атипичные протоки (см. ниже) часто тупиковые и агрессивный поджелудочный сок не находя выхода начинает переваривать окружающую ткань железы.

В отличие от большинства опухолей, клетки РПЖ могут образовывать только небольшие островки в обширной строме опухоли. Основными клеточными компонентами являются ассоциированные с раком фибробласты (CAF), преимущественно происходящие из звездчатых клеток поджелудочной железы (PSC) и воспалительных клеток. В склерозированной ткани мало кровеносных сосудов, в результате чего опухолевые клетки находятся в состоянии постоянной гипоксии и выживают наиболее агрессивные субклоны. А изоляция опухолевых клеток задерживает клинические проявления.

[albert52]

Продолжим.

Пищеварительные ферменты продуцируются клетками серозного ацинуса в большей экзокринной части поджелудочной железы. Каждый ацинус поджелудочной железы состоит из нескольких серозных клеток, окружающих очень маленький просвет. Ацинарные клетки поляризованы, с округлыми базальными ядрами и апикальными многочисленными гранулами зимогена, типичными для секретирующих белок клеток. Ацинусы окружены лишь небольшим количеством соединительной ткани с фибробластами.

Каждый ацинус дренируется коротким интеркалированным протоком с одинарным плоским эпителием. Клетки этих небольших протоков простираются в просвет ацинуса в виде небольших бледно-окрашенных центроацинарных клеток , уникальных для поджелудочной железы и выделяют большой объем жидкости, богатой HCO3 (бикарбонат-ионы), которая которая увлажняет, очищает и подщелачивает ферментативную секрецию ацинусов.
Эти пищеварительные ферменты включают в себя несколько протеаз, альфа-амилазы, липазы и нуклеазы ( ДНКазы и РНКазы ). Протеазы секретируются как неактивные зимогены ( трипсиноген, химотрипсиноген, проэластазу, калликреиноген и прокарбоксипептидазы). Так, ингибитор трипсина совместно упаковывается в секреторные гранулы с трипсиногеном, который расщепляется и активируется энтеропептидазами в двенадцатиперстной кишке, генерируя трипсин, который активирует другие протеазы в каскаде.

Интеркалированные протоки сливаются с внутрилобулярными протоками и более крупными межлобулярными протоками , которые имеют все более столбчатый эпителий, прежде чем присоединиться к основному протоку поджелудочной железы, который проходит по длине железы.
Все протоковые клетки имеют базовый уровень активации SOX9 генов, препятстующий превращению этих клеток в ацинарные и эндокринные клетки. Также для SOX9 была показана его связь с процессом регенерации ПЖ при повреждениях. Регенерационный потенциал во взрослом органе обычно связан с Ptf1a+ ацинарными клетками, в которых при повреждении ПЖ происходит факультативная реактивация мультипотентных факторов SOX9 и Hnf1β, в результате чего происходит ацинарно-протоковый переход (АПМ — ацинарно-протоковая метаплазия - см. выше).

Одной из основных проблем, стоящих перед этим заболеванием, является гетерогенность, наблюдаемая среди пациентов в отношении симптомов, клинической эволюции, предрасположенности к раннему метастазированию и чувствительности к лечению. Гетерогенность может возникать на разных этапах эволюции опухоли, начиная с первых генетических мутаций, которые привели к возникновению опухоли, ее взаимодействия с микроокружением и в результате давления отбора и клональной экспансии. Тем не менее, были охарактеризованы два клинических подтипа PDAC: базальный (сквамозный), с худшим прогнозом и классический. Базальный подтип частично - но не полностью - совпадает с типом плоских клеток и с EMT; он, как правило, более устойчив к различным химиотерапевтическим средствам и особенно к схеме лечения, называемой FOLFIRINOX (фолиевая кислота, 5-фторурацил (5-FU), иринотекан и оксалиплатин).

Эти фенотипы PDAC определяются различными эпигенетическими ландшафтами, в частности паттернами метилирования ДНК, которые трансдуцируются на уровне транскрипции и изменяют взаимодействие между опухолью и ее стромой. Так, ключевыми игроками в гетерогенности PDAC являются супер-энхансеры; комплекс SWI / SNF ремоделирования нуклеосом может регулировать эти супер-энхансеры, и, что интересно, генетические изменения у членов этого комплекса часты среди опухолей PDAC. Когда комплекс SWI / SNF не способен правильно собираться, он не может противостоять поликомбо-репрессивному комплексу, локализованному в промоторах и типичных энхансерах генов дифференцировки, и это нарушение равновесия способствует онкогенезу.
Поскольку природа подтипов PDAC не является генетической, можно было бы преобразовать оба подтипа просто путем инактивации MET в базальных или GATA6 в классических выборках, что в опухолях часто и происходит. В запущенных случаях между этими двумя крайними формами опухолевого фенотипа имеется континиум промежуточных состояний.

Согласно современной концепции развития ПАПЖ (протоковой аденокарциномы ПЖ), клетками-родоначальниками ее классического подтипа являются ацинарные клетки. Ключевым инициирующим событием является АПМ. Этот процесс активируется при остром панкреатите и непосредственно связан с регенерацией ПЖ. В норме это заканчивается редифференциацией «протоковых» клеток в ацинарные, однако при появлении дополнительных факторов могут развиться ПанИН-I, II, III и в конечном итоге инвазивная аденокарцинома.
РПЖ происходит в основном из ацинарных клеток, чувствительных к мутантному KRAS, но хотя при РПЖ эти клетки претерпевают изменения, больше дистрофические, но так как РПЖ обычно является следствием многократно повторяющего воспаления (явного или скрытого), то ацинарные клетки при этом метаплазируют скорее в подобие центроацинарных клеток, образуя как бы разветвленный воротник вокруг ацинуса. Со временем вследствие накапливающихся мутаций связи между клетками в этом воротнике слабеют и он разрывается, образуя клеточные обрывки. Эти обрывки и дают начало раку, большая их часть попадает под власть генов-предшественников и далее дают начало классическому подтипу, меньшая часть превращается в псевдомезенхимальные клетки и дает начало сквамозному (плоскоклеточному) подтипу (см. выше).

Таким образом в результате хронического воспаления центроацинарные клетки образуют полиповидные разрастания со всем спектром PANIN, но агрессивный рак образуется, когда эти полипы разрываются с образованием фрагментов разной величины. Более крупные фрагменты образуют трубчаые структуры, более мелкие - рыхлые пласты плоских клеток. Метастазируют и те, и другие, только судьбв метастазов разная.

Блуждающие клетки классического трубчатого подтипа образуют (простите за тавтологию) классические метастазы, напоминающие исходную структуру опухоли, только клетки сцеплены часто крепче, что впрочем не мешает им интенсивно размножаться. Более стойкие псевдомезенхимальные клетки плоскоклеточного подтипа могут долго блуждать, постепенно дичая и превращаясь в настоящих лангольеров и образуя скопления разных размеров по всему телу (их число может достигать сотек и даже тысяч).
Зрелые клетки протоков и ацинусов благодаря стройной системе генов дифференцировки и их защитников, в том числе эпигеномных, наскоком не возьмешь. В протоках могут образовываться сравнительно редко метастазирующие IPMN и MCN (см. выше), а клеткам ацинусов, когда им плохо, есть во что превращаться; первичный ацинарный рак наблюдается очень редко.

[albert52]

Продолжим.

Согласно новой классификации ПАК (протоковая аденокарцинома) ПЖ выделяются четыре главных молекулярных подтипа: сквамозный (квазимезенхимальный), панкреатический классический (из клеток-предшественников), иммуногенный и аберрантно-дифференцированный экзокрино-эндокриноподобный (ADEX).

Сквамозный подтип запускается ЕМТ-программой и характеризуется высокой экспрессией мезенхимальных маркеров и наихудшим прогнозом. Гистологически он включает железисто-плоскоклеточный рак ПЖ. Сквамозные опухоли богаты мутациями генов семейства TP53, отражающими активацию TP63ΔN и его транскрипционную сеть. Ген TP63ΔN стимулирует дифференцировку клеток плоского эпителия в противовес железистой дифференцировке эпителия протоков ПЖ.
Гиперметилирование генов, ответственных за апоптоз (PDX1, GATA6 и HNF1B), способствует развитию дедифференцированного и мезенхимального характера этого подтипа. Множество других фенотипических характеристик патогномоничны для сквамозного подтипа ПАК ПЖ: частые мутации гена KDM6A, ответственного за перестройку хроматина, сигнальный путь TGF-β, активацию гена MYC и т.д. Клеточные линии сквамозного подтипа более чувствительны к воздействию гемцитабина.

Панкреатический классический (из клеток-предшественников) подтип характеризуется наиболее эпителиальным характером ПАК ПЖ с высоким уровнем экспрессии эпителиальных маркеров, особенно CDH1/E-cadherin. Данный подтип по молекуляр -ному фенотипу подобен KRAS-зависимым клеточным линиям ПАК ПЖ. Также присуща высокая экспрессия генов, способствующих развитию ПЖ (FOXA2/3, PDX2, MNX1 и GATA6); например, PDX2 индуцирует начальную дифференцировку эпителия поджелудочной железы. В отличие от сквамозного, этот подтип происходит из клеточных линий, чувствительных к ингибитору EGFR – эрлотинибу. Любопытна взаимосвязь классического подтипа ПАК ПЖ с развитием “диабета молодых” (MODY).

В подтипе c аберрантной эндокринной-экзокринной дифференцировкой (ADEX) нарушена регуляция генов, играющих роль в ацинарной и эндокринной дифференцировке, которая носит в норме взаимно исключающий характер, также в процессах регенерации и при панкреатите. Часть этих генов связана с активацией KRAS. ПАК ПЖ подтипа ADEX гистологически связан с ацинарно-клеточным раком.

Иммуногенный подтип ПАК ПЖ отличается различными иммуно-ассоциированными транскрипционными программами. Эти программы связаны с сигнальными путями и рецепторами В- и Т-клеток, представлением антигена и приобретенной иммунной супрессией через ключевые моменты соответствующих путей – CTLA4 и PD1. Кроме того, иммуногенный подтип ПАК ПЖ демонстрирует существенное увеличение в инфильтрате В- и Т-клеток. Гистологически ПАК ПЖ этого подтипа проявляются в виде муцинозных некистозных (коллоидных) опухолей.
Отметим,что в целом ПАК ПЖ является "иммунно-холодной" (см.выше), что обьясняется как выраженными иммунносупрессивными свойствами опухолевых клеток (в тесном стромальном ложе особо не навоюешь), так и трудностями доставки иммунных клеток к опухоли. Вот и приходится выделять отдельныq подтип, где это затруднение как то устранено.
ПАК ПЖ в целом не чувствительна к новым классам ингибиторов анти-i-PD1 иммуномодуляторов импа пембролизумаб (почему - см.выше). Однако ПАК ПЖ иммуногенного подтипа могут быть чувствительными к препаратам этой группы либо сами по себе, либо в сочетании с другими химиотерапевтическими средствами.

Молекулярные механизмы канцерогенеза РПЖ

Молекулярные изменения, которые накапливаются во время канцерогенеза поджелудочной железы, можно классифицировать на ранние (укорочение теломер и активирующие мутации в KRas в PanIN-1), промежуточные (инактивирующие мутации или эпигенетическое молчание CDKN2A в PanIN-2) и поздние (инактивирующие мутации р53 и SMAD4 в PanIN-3) события. Во время формирования PanIN могут также происходить мутации в других генах, впрочем наиболее значимо накопление мутаций, а не появление их в определенном порядке.
Наиболее распространенной является мутация в онкогене K-ras (встречается в 90% случаев). Приобретение онкогенной мутации KRas в ацинарных клетках поджелудочной железы приводит к их трансдифференцировке в протоковидные клетки.

Онкогенные KRas могут также модулировать митохондриальный метаболизм и выработку АФК посредством регуляции рецептора трансферрина (TfR1), который высоко экспрессируется в ракe поджелудочной железы. Кроме того, КRas могут вызвать подавление дыхательной цепи комплекса I и III, приводя к митохондриальной дисфункции (что-то напоминает).

Ген Р16/CDKN2A при РПЖ инактивируется наиболее часто (в 95% наблюдений). Белок р16 играет критическую роль: его инактивация приводит к утрате контроля над клеточным циклом, так как продукт гена p16 INK4а ингибирует взаимодействие циклина D с циклин -зависимой киназой 4 (CDK4). В спорадических опухолях p16 иногда инактивируется гомозиготными делециями и внутригенными мутациями, а в остальном ген INK4a выключается путем метилирования промотора.

Ген-супрессор опухолей DPC4 расположен на хромосоме 18q21 и кодирует ядерный фактор транскрипции Smad 4 - важный элемент TGF-ß сигнального пути. При раке поджелудочной железы DPC4 был инактивирован в 55% наблюдений, а при других злокачественных опухолях инактивация этого гена происходит очень редко.

Канонический каскад передачи сигналов Smad инициируется фосфорилированием рецептор-регулируемых факторов транскрипции Smad (R-Smads) Smad2 и/или Smad3 активированным ALK5 (Anaplastic Lymphoma Kinase). Это позволяет связывать R-Smad с Smad4 и транслокацию комплекса в ядро, где он может привлекать транскрипционные коактиваторы или корепрессоры к Smad-связывающим элементам (SBE) в промоторах генов-мишеней TGF-β. Отметим, что потеря функции SMAD4 почти всегда происходила в связи с генетической инактивацией TP53 , но не наоборот, указывая на то, что изменения SMAD4 были связаны с генетическими изменениями TP53 .
Эта взаимосвязь также предполагает, что инактивация SMAD4 происходит позже, чем инактивация TP53. Трансформирующий фактор роста (TGF -β) действует как супрессор опухоли во время инициации рака, но как промотор опухоли во время прогрессирования опухоли. Рост опухолевых клеток TGF-β способен ингибировать путем тормозного взаимодействия с циклином D1.

При инвазивной карциноме гиперактивирован сигнальный путь Hedgehog; эта активация может быть зависимой от лиганда Hedgehog (при РПЖ) или из-за мутации Patched (при базально-клеточном раке кожи). Ингибирование этого пути препаратом циклопамином останавливает рост опухоли в эксперименте.

[albert52]

Продолжим.

Ген р53. При раке поджелудочной железы инактивация этого гена-супрессора опухолей определяется в 50-70% наблюдений. р53 — это ядерный ДНК-связывающий белок, который влияет на старение клетки и контролирует клеточный цикл, запускает процесс клеточной гибели (апоптоз). Мутации в гене TP53 отменяют его функцию, приводя к генетической нестабильности и прогрессированию опухоли. р53 ингибирует клеточный цикл путем прямой инактивации CDK4 и косвенной инактивации p21, то есть функционирует на переходе G1 / S, блокируя вход в S-фазу, вызванный повреждением ДНК. Функции p53 также поддерживают геномную стабильность.
Потеря p53 связана с анеуплоидией, выдающейся особенностью карциномы поджелудочной железы; вообще на сегодняшний день большинство генов, которые считаются супрессорами метастазирования, демонстрируют признаки гаплоиндуцированности. Инактивация TP53 при SMAD4 дикого типа сильно обогащена нулевыми мутациями (нонсенс, делеция или сдвиг рамки), а при сопутствующей потере SMAD4 - миссенс-мутациями. При этом потеря SMAD4 частично устраняет остаточные цитостатические или апоптотические функции миссенс-мутантных белков TP53

Специфические ингибиторы COX2 (СОХ — группа ферментов, участвующие в синтезе простаноидов, таких как простагландины, простациклины и тромбоксаны) могут предотвращать канцерогенез и вызывать апоптоз опухолевых клеток. Также путь липооксигеназы (LOX) превращает арахидоновую кислоту в мощные сигнальные медиаторы, такие как лейкотриен B4 (LTB4), способствующий развитию и прогрессированию рака человека. Сверхэкспрессия рецепторов LOX и LTB4 при раке поджелудочной железы человека образует аутокринную петлю, которая стимулирует пролиферацию клеток.

Активированные гены подтипа предшественников поджелудочной железы в основном участвуют в развитии поджелудочной железы (например, GATA6, BMP2, PDX1 и SHH) и передаче сигналов Ras (например, KITLG и RASA3). Плоскоклеточный (сквамозный) подтип демонстрирует обогащение путей с сильным онкогенным потенциалом (например, PI3K-AKT, Hippo и WNT), способствующим EMT (например, передача сигналов TGFβ) и дерегулирование генов, участвующих в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток (например, YAP1, CD44 , MYC и E2F7). Отметим, что устранение Kras приводит к переключению в сторону плоскоклеточного подтипа.
Впрочем подтипы опухолей лучше определяются специфическими эпигенетическими, транскрипционными и стромальными ландшафтами, чем генными мутациями (см. выше). А если эпигеном является основным фактором, ответственным за фенотипы PDAC, главное заключается в том, что это обратимое явление, а генетические мутации - нет.

К эпигенетическим регуляторам, обнаруженным в PDAC, относятся H3K4-метилтрансферазы MLL2 и SETD3 и H3K-ацетилтрансфераза KAT2A, которые активируют транскрипцию. Другим регулятором, сверхэкспрессированным во всех образцах PDAC, является энхансер Zeste Homolog 2 (EZH2). Этот фермент является функциональным компонентом субъединицы 2-го репрессивного комплекса ремоделяции хроматина (PRC2) и катализирует триметилирование H3K27, в результате чего хроматин плотнее окутывает ДНК и мешает транскрипции.

Поликомб-репрессированные комплексы подавляют гены-супрессоры опухолей и гены пути Hedgehog (см. выше). Первый в своем классе пероральный селективный ингибитор EZH2, таземетостат показал благоприятные результаты у пациентов с рефрактерной В-клеточной неходжкинской лимфомой и запущенными солидными опухолями. NUPR1 является белком, который сверхэкспрессируется во время острого панкреатита, и участвует в ремоделировании хроматина посредством его взаимодействия с белками группы поликомб. Спиральные пептиды, предназначенные для нацеливания на NUPR1, оказывают кратковременный лечебный эффект.

Метилирование ДНК таким образом является эпигенетической меткой, которая вызывает молчание генов, удерживая ДНК в транскрипционно спокойном состоянии. Зебуларин, известный ингибитор метилирования ДНК, подталкивает стволовые клетки PDAC к более пролиферативному фенотипу с повышенной чувствительностью к современным химиотерапиям. Существует также подгруппа опухолей PDAC, которые были чувствительны к хорошо изученному децитабину.

Гистондеацетилаза 1 (HDAC1) является еще одним эпигенетическим модификатором, который сверхэкспрессируется в PDAC и может нарушать регуляцию паттерна ацетилирования гистона, что в целом активирует транскрипцию. В частности, более высокие уровни экспрессии HDAC 1, 7 или 8 связаны с худшей общей выживаемостью. Ингибирование HDAC может привести к активации генов-супрессоров опухоли.
Некодирующие РНК (нкРНК) транскрипты играют роль эпигенетических модификаторов, взаимодействуя с гистоновыми модифицирующими комплексами или с DNMT (DNA methyltransferase). Среди нкРНК лучше всего изучены микроРНК (миРНК), которые действуют как посттранскрипционные репрессоры, а в предраковых поражениях PDAC подавление miR-148, наряду с miR-217 и miR-375, является мета-сигнатурой PDAC. Различные стратегии доставки могут быть выполнены для восстановления уровней экспрессии miRNA. Одним из них является использование «нановекторов», которые состоят из липидных наночастиц. Они были успешно использованы для доставки miR-34a из транскрипционной сети p53 и кластера miR-143/145, который подавляет экспрессию KRAS2 в раковыклетках.

В целом, развитие эпигенетических лечебных препаратов сталкивается с несколькими проблемами, одной из наиболее важных из которых является отсутствие специфичности: все эпигенетические методы лечения влияют на общий геном. Кроме того, следует учитывать гетерогенность, поскольку маловероятно, что одно эпигенетическое лекарственное средство, отдельно или в сочетании с современными методами лечения, будет эффективным для всех опухолей.

[albert52]

Вставка

Генный профиль развития ПЖ

Морфологические изменения, которые происходят при дифференциации поджелудочной железы от энтодермы кишечника, зависят от последовательных изменений в экспрессии генов. Внеклеточные сигналы, обеспечиваемые тканевыми взаимодействиями между развивающейся энтодермой поджелудочной железы и соседними тканями, в конечном итоге влияют на фенотип клетки, изменяя экспрессию генов в ядре.

Самыми ранними генами, избирательно экспрессируемыми в препанкреатической энтодерме, являются два фактора транскрипции, фактор гомеодомена парахокс PDX1 и фактор транскрипции основной спирали-петля-спираль (bHLH) PTF1A. Экспрессия PDX1 впервые появляется в препанкреатической энтодерме более чем за 1 день до начального формирования дорсального зачатка поджелудочной железы, и ей непосредственно предшествует появление другого парахокс-фактора, MNX1 (также известного как HB9), который в передней энтодерме экспрессируется более широко, чем PDX1. Экспрессия как MNX1, так и PDX1 сохраняется в начальных зачатках поджелудочной железы, хотя экспрессия MNX1 быстро гасится, в то время как экспрессия PDX1 еще какое-то время продолжается. В зрелых β-клетках реактивируется экспрессия обоих факторов.

Есть несколько дополнительных факторов энтодермальной транскрипции как потенциальных внутренних регуляторов экспрессии PDX1. К ним относятся такие члены семейств факторов транскрипции как HNF1 и Foxa, Onecut1, парный гомеодоменный фактор PAX6, ну и сам PDX1. HNF1a и PAX6 экспрессируются недостаточно рано или широко, чтобы инициировать раннюю экспрессию PDX1 в эмбриональном кишечнике и зачатках поджелудочной железы, но паттерны экспрессии Onecut1, HNF1b, Foxa1 и Foxa2 предполагают, что они в совокупности могут играть эту роль.
PDX1 необходим для роста зачатков поджелудочной железы; делецмя гена, кодирующего PDX1 человека, была идентифицирована у людей с агенезом поджелудочной железы. Экспрессия PTF1A следует вскоре после PDX1 и хотя он первоначально был описан как экзокринно-специфический фактор транскрипции, фактически он играет важную роль в определении судьбы всех клеток поджелудочной железы.

Поджелудочная железа состоит из трех основных типов клеток: эндокринных клеток, ацинарных клеток и протоковых клеток. Их развитие строго контролируется регуляторной сетью факторов транскрипции, которые модулируют экспрессию генов. В эту сеть включены факторы транскрипции гомеобокса (PDX1, Pbx1, HB9), факторы транскрипции гомеопротеинов парного бокса (Pax4, Pax6), факторы транскрипции Forkhead Вох (Foxa1, Foxa2) и факторы транскрипции основной спирали-петли-спирали (bHLH) (ptf1a / p48, Mist1, нейрогенин3, NeuroD).

Факторы транскрипции bHLH особенно важны для событий развития и дифференцировки из-за комбинаторной природы этих белков. Факторы bHLH подразделяются на две основные группы - белки класса A, которые включают широко экспрессируемые белки E12 / E47 / HEB, и белки класса B, которые демонстрируют ограниченный тканью паттерн экспрессии.
В большинстве случаев предпочтительный комплекс bHLH представляет собой гетеродимер, состоящий из члена класса A и члена класса B. Эти гетеродимеры связываются с сайтами E-box, обнаруженными в промоторных и энхансерных областях генов-мишеней, чтобы регулировать их транскрипцию. Из класса В ген Neurogenin3 является нижестоящей мишенью передачи сигналов Notch и необходим для развития всех клонов эндокринных клеток поджелудочной железы. NeuroD , нижестоящий ген-мишень Neurogenin3, служит ключевым регулятором транскрипции гена инсулина в β-клетках.

Ptf1a предпочтительно собирается в тримерный комплекс транскрипции PTF1 с белком E и Rbpj (или Rbpjl). Регулятор транскрипции RBPJ, иначе известный как CSL ("CBF-1, супрессор Hairless, Lag-2"), представляет собой высококонсервативный ДНК-связывающий белок, который играет центральную роль в решении судьбы клеток метазоа. RBPJ обеспечивает каноническую передачу сигналов Notch. В развитии поджелудочной железы Ptf1a незаменим для контроля роста мультипотентных клеток-предшественников, а также для спецификации и поддержания ацинарных клеток.

Как только идентичность поджелудочной железы установлена, морфогенез ветвления в MPCs (мультипотентных стволовых клетках) ведет к разделению на верхушечные и клетки ствола, предшественники ацинарных и протоковых структур соответственно. Первоначально коэкспрессируясь, Nkx6-1 становится ограниченным стволом, а Ptf1a - концевыми клетками. Последние показывают экспрессию Myc (c-Myc), тогда как клетки ствола определяются активностями генов Hnf1b, Sox9, Hnf6 и Hes1. Кроме того, расширение и поддержание экзокринного компартмента дополнительно поддерживается ингибированием пути Hippo для репрессии специфичных для эндокринной системы генов TF, включая Pax6, Ngn3, Isl1 и Nkx6-1, а также Gcg и Ins1 / 2. Активные сигналы Hippo, кстати, противодействуют активности Yap, способствуя эндокринной судьбе.

В концевых клетках Ptf1α индуцирует Nr5a2, который имеет решающее значение для ацинарной идентичности, поскольку Nr5a2 напрямую регулирует Ptf1a в петле обратной связи, а также Gata4 и Rbpjl. Эндокринный компартмент появляется в нескольких отдельных клетках внутри ствола, которые активируют Ngn3, предположительно за счет латерального ингибирования генов экзокринной дифференциации, организованного путем Notch.

Zeb1, известный EMT-TF, экспрессируется на низких уровнях в эпителиальном компартменте развивающейся поджелудочной железы. В отличие от роли Snail и Slug во время расслоения эндокринных клеток островков Лангерганса, Zeb1 является критическим для спецификации в правильных соотношениях клонов клеток в эмбриональном периоде и для тканевого гомеостаза в поджелудочной железе взрослых.
Временные волны экспрессии TF инициируют созревание эндокринных клеток, чтобы гарантировать однонаправленную спецификацию уникальных типов клеток, включая Neurod1, Insm1 и Rfx6, потеря которых ставит под угрозу идентичность и функцию островковых клеток.

Идентичность ацинарных клеток поддерживается несколькими взаимодействующими ТФ, такими как Ptf1α (см. выше) и Mist1. Подавление этих TF приводит к приобретению характеристик клеток-предшественников и увеличению образования ADM и PanIN, что подчеркивает важность поддержания экспрессии этих факторов идентичности для предотвращения инициации опухоли.

MIST1 представляет собой мастер TF, принадлежащий к семейству В белков с основной конфигурацией (доменом) спираль-петля-спираль (bHLH). MIST1 экспрессируется в серозных экзокринных клетках, включая ацинарные клетки поджелудочной железы. Вне поджелудочной железы MIST1 экспрессируется в ацинарных клетках слезных, околоушных и поднижнечелюстных слюнных желез, главных клетках желудка, альвеолярных клетках лактирующих молочных желез и секретирующих клетках, выстилающих простату и семенные пузырьки.
В поджелудочной железе MIST1 локализуется в ядрах ацинарных клеток; не наблюдается его экспрессии в протоковых или центроацинарных клетках. MIST1 является мишенью транскрипционного фактора XBP1, который также играет физиологическую роль в ацинусах поджелудочной железы. Белок MIST1 может также образовывать гетеродимеры с другими факторами транскрипции bHLH, что типично для этих белков. Однако, в отличие от других белков bHLH, MIST1, по-видимому, преимущественно работает как гомодимер.

Экзокринные клетки с выпадением гена Mist1 имеют дефект митохондриальной локализации и движения кальция, что, вероятно, является основной причиной снижения базального и регулируемого экзоцитоза, проявляемого этими клетками. При этом репрессируется Atp2c2 (ген, кодирующего секреторный путь Ca 2+АТФаза 2 (SPCA2), который участвует в поступлении кальция из клеточного депо. MIST1 также нацелен на p21 pCIP / WAF, вызывая задержку роста ацинарных клеток, что позволяет предположить, что в отсутствие MIST1 фенотип зрелых ацинарных клеток более пластичен (см. рак желудка). Также может наблюдаться спонтанный панкреатит и большая чувствительность к разным повреждающим факторам.

MIST1 также снижает способность онкогенного Kras вызывать PanIN. В эксперименте при делеции гена MIST1 KrasG12D значительно ускоряет образование PanIN, и мыши становятся нежизнеспособными из-за почти полного отсутствия ацинарной ткани, замещенной протоковым эпителием. Эти аффекты отменяются принудительным выражением MIST1. Mist1 также активирует экспрессию p21 CIP1 / WAF1 посредством уникального пути Sp1.

[albert52]

Молекулярные механизмы канцерогенеза РПЖ (продолжение)

Многочисленные сигнальные пути через стимулированные рецепторы факторов роста передают свои последующие эффекты через факторы обмена гуанином RAS (RAS-GEFs), которые активируют белки семейства RAS, KRAS, HRAS и NRAS. Напротив, негативные регуляторные пути индуцируют белки-активаторы ГТФазы RAS (RAS-GAP), которые осла***ют передачу сигналов RAS. Онкогенные мутации KRAS - в кодонах 12, 13 и 61 - продуцируют конститутивно активные формы KRAS, устраняя необходимость в восходящих индуцирующих сигналах и делая белок нечувствительным к ингибированию. Активированный KRAS задействует множество эффекторных путей, в частности, киназу, активированную митогеном RAF (MAP-киназу), фосфоинозитид-3-киназу и пути RalGDS.
В дополнение к роли в инициации опухоли, похоже, что активация KRAS необходима для поддержания онкогенного роста установленного PDAC, поскольку нарушение активности KRAS - через интерференцию РНК, антисмысловую РНК или экспрессию доминантно-отрицательного KRASN17 - осла***ет онкогенность клеточных линий PDAC. Следовательно, активность KRAS, по-видимому, необходима на всех этапах канцерогенеза протоков поджелудочной железы, и, таким образом, активированный KRAS или его эффекторы, вероятно, будут подходящими мишенями для профилактики и лечения этого злокачественного новообразования.

Экспрессия онкогенного Kras в ацинарных клетках индуцирует трансдифференцировку в протоковые клетки во время ADM; этот процесс предшествует формированию повреждений PanIN и в конечном итоге вызывает PDAC. Инициация PDAC может также развиваться отдельно от ацинарных или протоковых клеток по PanIN-независимому механизму. Сходным образом экспрессия Kras G12D в сочетании с гаплонедостаточностью Smad4 ведет к последовательному прогрессированию поражений MCN в сторону отдельного класса PDAC.

Gata6 необходим для терминальной дифференцировки и гомеостаза ацинарных клеток и установления полярности. Установлено, что инактивация Gata6 вызывает массовую потерю ацинарных клеток и способствует развитию ADM в поджелудочной железе. GATA6, среди других генов, кодирующих TF, определяющих судьбу энтодермальных клеток, подавляется в плоскоклеточном подтипе PDAC посредством гиперметилирования промотора. В соответствии с этим, экспрессия GATA6 преимущественно выявлялась в хорошо дифференцированных опухолях низкой степени злокачественности.

Pdx1 часто подавляется гиперметилированием во время прогрессирования в сторону плоскоклеточного подтипа PDAC. С другой стороны, PDX1 является частью транскрипционной сети, определяющей судьбу клеток энтодермы в сторону поджелудочной железы, и его присутствие приводит к лучшему прогнозу для подтипа предшественников PDAC. В целом Pdx1 действует как контекстно-зависимый TF во время инициации и прогрессирования PDAC: он переключается с защиты идентичности ацинарных клеток во время раннего туморогенеза на онкоген после установления ADM.

Экспрессия Sox9 в поджелудочной железе взрослого человека ограничена цитокератин-положительными клетками протока, включая центроацинарные клетки. Во время образования опухоли было показано, что Sox9 индуцируется в ADM и PanIN и поддерживается в подтипе PDAC предшественника поджелудочной железы. Важно, что ADM и PanINs, происходящие из ацинарного компартмента, нуждаются в эктопической индукции Sox9. Совместная экспрессия онкогенного Kras и Sox9 дикого типа способствует индукции предшественников поражений из ацинарного компартмента. В целом ADM, зависит от комбинированной экспрессии Sox9 и Hnf6, поскольку сверхэкспрессия Hnf6 также запускает ADM.
Сверхэкспрессия SOX9 не влияет на частоту IPMN, но снижает образование PDAC, демонстрируя, что Sox9 является основной нижестоящей мишенью Arid1a и предотвращает прогрессирование опухоли, способствуя протоковой дифференцировке. В конце концов, Sox9 является критическим медиатором идентичности протоков или предшественников. Из-за его встраивания в множественные сигнальные пути и петли обратной связи в спецификации клеточного типа, его дерегулированная экспрессия в конечном итоге связана с ранним туморогенезом.

В поджелудочной железе взрослых экспрессия Notch мишени Hes1 ограничена центроацинарными и протоковыми клетками, при этом регуляция Hes1 с помощью активной передачи сигналов Notch наблюдалась во время формирования ADM и PanIN. Notch-индуцированный Hes1 контролирует рост недифференцированной популяции клеток-предшественников как во время эмбриогенеза, так и при онкогенезе, способствуя таким образом Kras-опосредованному инициированию и прогрессированию опухоли. В этом контексте активация Notch сенсибилизирует ацинарные клетки к мутантному Kras-индуцированному инициированию и прогрессированию ADM / PanIN.
Кстати, при потере Hes1 может произойти ускорение онкогенеза PDAC за счет образования опухоли по прямому пути от ADM к PDAC, который пропускает предраковые поражения PanIN (не помнящая родства).

Таким образом, формирование PDAC зависит от ранних предопухолевых событий, таких как ADM, который основан на подавлении TF, которые контролируют идентичность ацинарных клеток, включая Gata6, Mist1 и Ptf1α, и прироста TF, которые способствуют протоковой спецификации, включая Pdx1, Sox9 и Hes1. Клетки ADM также приобретают свойства, не похожие на протоки, за счет активации Pdx1, приобретая более сходные с ранними предшественниками характеристики.

Активация определенных нижестоящих медиаторов KRAS способна способствовать переходу к плоскоклеточному подтипу. Сверхэкспрессия Etv1 индуцирует все основные EMT-TF и молекулярные маркеры, связанные с мезенхимальным фенотипом (например, Vim, Mmp3 и Mmp9), тогда как нокдаун Etv1 снижает уровни Zeb1. Также повышение HAS2 способно подпитывать самоподдерживающуюся петлю обратной связи CD44 и ZEB1, которая включает дифференциальный сплайсинг CD44 с помощью ESRP1, дополнительно способствуя EMT.

MAZ действует ниже KRAS и способствует передаче сигналов CRAF-MAPK с участием PAK и подавлению AKT / PKB. Более того, повышающая регуляция MAPK или инактивация TP53 приводит к сверхэкспрессии KLF7, способствуя росту опухоли и метастазированию. Экспрессия KLF7 активирует IFN-стимулированные гены и стабилизирует целостность аппарата Гольджи и, таким образом, гликозилирование белков для усиления секреции факторов роста, способствующих развитию рака.
В сотрудничестве с Myc Yap1 поддерживает экспрессию метаболических генов, необходимых для пролиферации и выживания. При удалении Yap1 подмножество опухолевых клеток было способно восстанавливать уровни Myc, обеспечивая выживание клеток за счет индукции генов, кодирующих EMT-TFs Snail, Zeb2, Twist2 и фактор стволовости Sox2, тем самым компенсируя потерю Yap1.

При устранении KrasG12D были идентифицированы другие компенсаторные механизмы, включая индукцию репрессора транскрипции Gli2, нижестоящего медиатора пути SHH. При этом индукция GLI2 способствует переключению сигнатуры гена с панкреатического предшественника на плоскоклеточный подтип, что сопровождается снижением маркеров эпителиальной идентичности (E-кадгерин, ESRP1, GATA6 и SHH) и повышением экспрессии EMT / маркеры стволовости (ZEB1, VIM, CK14, SOX2 и CD44).