Очерк натуральной онкологии

[albert52]

Продолжим.

За первоначальным всплеском пролиферативной активности гепатоцитов следуют вторичные волны митоза, пока не восстановится первоначальная масса печени. В остановку роста вовлечено множество факторов, включая семейство TGF-ß (TGF-ß1, активины), IL-1 и гены-супрессоры опухолей (p53, p21). TGF-ß1 является известным супрессором пролиферации гепатоцитов и индуктором апоптоза. Отметим, что уровни TGF-ß в плазме повышаются вместе с HGF, указывая на то, что цитокин высвобождается после ремоделирования внеклеточного матрикса, где он связывается с декорином. Однако чувствительность регенерирующей печени к этому фактору временно снижается, в частности из-за снижения уровня НАДФН-оксидазы NOX4, опосредующей апоптоз, индуцированный TGF-β; в конце LR его уровень восстанавливается. Это должно быть дополнительным механизмом, позволяющим избежать супрессорных эффектов TGF-β во время раннего процесса регенерации печени.

Среди других игроков, связанных с фазой терминации, определенную роль должна сыграть интегрин-связанная киназа (ILK). ILK находится под плазматической мембраной, связан с интегрином ß1, подавляющим рост гепатоцитов. Еще следует упомянуть снижение экспрессии Yap (Yes-ассоциированный белок), контролируемой путем Hippo и считающейся центральным игроком, контролирующим размер клеток и, в частности, гепатостатическую функцию печени. Таким образом, правильный баланс всех этих сигналов во время разных фаз может быть важным фактором, определяющим эффективность LR.

Когда печень повреждена определенными химическими веществами, когда повреждение серьезное или когда зрелые гепатоциты не пролиферируют, вклад стволовых клеток печени / клеток-предшественников (LS / PC или HPC) имеет решающее значение для успеха LR. Реакция LS/PC включает активацию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку, в конечном итоге приводящая к образованию гепатоцитов или холангиоцитов.

HGF, EGF, TGF-α и SCF стимулируют пролиферацию LS/PC. Напротив, TWEAK/Fibronectin 14 будет участвовать в активации, а SDF-1/CXC рецептор 4 (SDF-1/CXCR4) будет участвовать в миграции этих клеток. Наконец, пути Wnt и Notch участвуют в противоположных ролях: в то время как первые направляют LS/PC к судьбе гепатоцитов, вторые способствуют их дифференцировке в сторону билиарного клона. Также воспалительная микросреда регулирует размножение и судьбу клеток-предшественников.

Предполагают, что и гепатоциты и холангиоциты могут быть сами по себе клетками-предшественниками печени при трансдифференцировке от одного типа клеток к другому, действуя как «факультативные стволовые клетки». Также стволовые клетки из внепеченочных участков, в частности костного мозга (КМ), могут участвовать и вносить вклад в LR, хотя и с низкой эффективностью.

В норме LS/PC располагаются в каналах Геринга; эти каналы соединяют канальцевую систему гепатоцитов и билиарное дерево, и такое расположение LS/PC согласуется с их бипотенциальными свойствами. Активация компартмента LS/PC в печени человека называется протоковой реакцией из-за роли активации протокового эпителия. В нише HPCs окружены эпителиальными и непаренхиматозными клетками, иммунными клетками и компонентами ECM, которые транспортируют активирующие сигналы. TNF-подобный слабый индуктор апоптоза (TWEAK) является членом суперсемейства TNF и основным индуктором активации HPC. Макрофаги и NK-клетки являются первичными источниками этих лигандов, а взаимодействие с клетками-мишенями осуществляется FGF-индуцируемыми рецепторами.

Низкие уровни активных форм кислорода способствуют пролиферации HPC посредством киназы 1/2, а транс-ретиноевая кислота, которая является важным активным метаболитом витамина А, участвует в дифференцировке HPC путем увеличения экспрессии miR-200a, которая регулирует клеточную аутофагию. Аутофагия также может регулировать дифференцировку HPC в BEC, поскольку она ингибирует сигнальный путь Notch1, необходимый для развития клеток желчных протоков. Следовательно, аутофагия снижается на ранних стадиях регенерации печени.

Недавно в перибилиарных железах, представляющих собой эпителиальные инвагинации внепеченочных и крупных внутрипеченочных желчных протоков, был идентифицирован новый пул мультипотентных билиарных клеток-предшественников, которые могут дифференцироваться в гепатоциты, BECs и островки клеток Лангерганса. Этот пул был назван стволовыми/прогениторными клетками билиарного дерева (BTSC). BTSC в первую очередь участвуют в регенерации билиарного эпителия при хронических заболеваниях, таких как первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома.

Как HCC, так и ICC являются гетерогенными заболеваниями с точки зрения клеточной морфологии и клинического исхода; также сообщалось о комбинированной ГК-холангиоцеллюлярной карциноме (HCC-CCA ), содержащей субпопуляцию клеток, экспрессирующих различные маркеры стволовых клеток. При ГК (HCC) маркеры РСК включают молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), CD133, CD90, CD44, CD24, CD13, или активность альдегиддегидрогеназы.

Регенерация печени после серьезной операции также может активировать скрытые микрометастазы и способствовать росту опухоли, что приводит к рецидиву опухоли печени. Хотя операция на печени может обеспечить долгосрочный контроль у некоторых пациентов с ранним ГК, частота рецидивов опухоли высока и составляет примерно 50% при 3-летнем наблюдении после резекции печени. Наличие сателлитных поражений, внутрипеченочная микроваскулярная инвазия и плохая гистологическая дифференциация являются маркерами рецидива и н***агоприятного прогноза, причем чем короче период времени от первичной операции до диагностики рецидива, тем хуже прогноз. Повторная гепатэктомия здесь, по-видимому, является лучшим методом лечения с частотой резектабельности от 10% до 77%.

Факторы, связанные с самим хирургическим стрессом, представляют собой преходящие изменения, тогда как процесс регенерации печени может выступать более сильным и устойчивым стимулом, способствующим росту скрытых опухолей и развитию новообразований. Рост опухоли требует баланса факторов роста и цитокинов в микроокружении, чтобы способствовать ангиогенезу. Ингибиторы ангиогенеза, белки ЕСМ и их фрагменты являются определяющими для поддержания состояния покоя; разрушение и восстановление ВКМ во время регенерации печени необходимы для активизации этих микрометастазов. Кстати, ингибирование опухолевой пролиферации и ангиогенеза было предложено посредством блокады ренин-ангиотензиновой системы (РАС).

В онкогенезе различные пути, активируемые HGF (см. выше), включают ERK1/2/MAPK и PI3K/Akt; известно, что эти сигнальные каскады являются классическими путями выживания, участвующими в уменьшении повреждения печени и улучшении регенерации печени после. Как и в оси HGF-cMet, активация таких путей выживания защищает от повреждения печени и способствует ее регенерации, но также может способствовать в присутствии неопределяемых микрометастазов развитию опухоли. Примечательно, что взаимодействие между сигнальными путями Ras / Raf / MEK / ERK и PI3K / Akt может приводить к регуляции роста и развития клеток в большей степени, чем один из них.

Конститутивная активация пути Ras / Raf / MAPK наблюдалась в HCC, что указывает на его роль в онкогенезе. В солидных опухолях путь RAF / MEK / ERK обычно активируется двумя основными механизмами: (1) онкогенные мутации в гене RAS, что приводит к конститутивной активации RAF, и (2) активная конститутивная RAF, возникающая в результате нарушение гиперэкспрессии факторов роста и их рецепторов. Так, сообщалось, что фосфорилирование MEK1 / 2 увеличивается в семь раз в тканях ГЦК по сравнению с соседними доброкачественными тканями.

Raf / MEK / ERK - это повсеместный путь передачи сигнала, активируется связыванием нескольких факторов роста с рецепторами, что, в свою очередь, активирует комплекс молекулы адаптера, известный как GRB2 / SHC / SOS, который и запускает путь RAF / MEK / ERK. ERK1 / 2 регулируют клеточную активность, воздействуя на различные субстраты в цитоплазме и ядре, причем существует путь обратной связи, регулирующий активность B-Raf, Raf-1 и MEK1 посредством активации ERK.
Недавно биологические исследования показали, что аберрантная активация сигнального пути Raf / MEK / ERK является центральной для роста, выживаемости и подвижности рака, а также для механизмов адресной терапии резистентности. Так, сорафениб является ингибитором киназы Raf-1 и является единственным одобренным лекарственным средством для лечения ГЦК.
Кстати, механизм канцерогенеза ГЦК может быть связан с активацией пути Ras / Raf / MEK / ERK инфекцией HCV. Так, коровый белок HCV вместе с тканевым активатором плазминогена может способствовать влиянию на MEK1 вышестоящей протеинкиназы.

[albert52]

Продолжим.

В сигнальных каскадах очень важную роль играют каркасные белки. Они позволяют образовывать белковые комплексы, взаимодействующие с широким спектром клеточных мишеней. Они объединяют два или более белков, например мембранные рецепторы/транспортеры и цитоплазматические сигнальные молекулы, в относительно стабильной конфигурации, образуя макромолекулярные комплексы. Белки каркаса оказывают свое влияние посредством простого связывания сигнальных белков, правильной ориентации целевых белков или аллостерической сборки компонентов сигнального пути. Они могут усиливать специфичность передачи сигналов путем секвестрации белков, предотвращая нежелательное перекрестное влияние между белками в различных путях передачи сигналов. Они также могут повысить эффективность передачи сигналов за счет увеличения локальной концентрации каждого компонента передачи сигналов.

Каркасы способствуют координации и положительной или отрицательной регуляции специфических сигнальных путей. В этом отношении, в зависимости от субклеточной локализации, из которой исходят активирующие сигналы, определенные каркасы определяют, какие субстраты могут быть фосфорилированы (киназы активируют белки - мишени путем фосфорилирования). Было высказано предположение, что каркасы могут защищать киназы от дефосфорилирования, что может быть связано с тем, что фосфатазы свободно диффундируют и, следовательно, присутствуют в гораздо более низких локальных концентрациях, или фосфатазы могут быть в каркасе стерически затруднены. Отметим, что терминальная киназа должна быть связана довольно свободно, чтобы искать мишени в цитоплазме и ядре после ее активации. Так, в клетках млекопитающих путь MAPK через терминальную киназу ERK запускает различные и часто противоположные клеточные исходы, которые включают пролиферацию, апотоз, миграцию и дифференцировку клеток.

Отметим, что среди регуляторных белков, которые связаны с составляющими сигнального каскада, общепринятым условием для рассмотрения белка как «каркаса» является его способность одновременно связываться по крайней мере с двумя членами такого каскада, образуя функционально стабильный комплекс (затвор для белков). Список белков млекопитающих, которые квалифицируются как каркасы для пути RAS-ERK, постепенно расширился до 15 с лишним членов (всего известно 78 каркасных белков для сигнальных киназных путей, причем 60% каркасных белков связаны с более чем одним путем).

Некоторые частично перекрывающиеся пути участвуют в различных биологических процессах и могут регулироваться различными белками каркаса. Например, один сигнальный путь, а именно PLK1 → WEE1 → CDC2 → CDC25C, связан с каркасным белком PIN1. Этот путь частично перекрывается с путем CDC2 → CSNK2A1 → AKT1, который связан с каркасным белком тирозин-протеин-фосфатазой нерецепторного типа 1 (PTPN1). Хотя CDC2 участвует в обоих путях, два каркасных белка могут обеспечивать специфичность сигнальных путей и предотвращать возможные нежелательные перекрытия между путями.

Также они играют центральную роль в качестве пространственных регуляторов сигналов ERK. Концептуально, если мы рассмотрим клетку, в которой сигналы ERK настраиваются независимо с помощью 15 белков каркаса, большинство из которых действуют специфично для сублокализации, любое изменение экспрессии одного из них должно влиять на общую активность ERK только примерно на одну пятнадцатую. Однако, похоже, это не так. Это можно легко представить, учитывая, что сверхэкспрессия любого каркаса должна оказывать влияние на другие виды каркасов, которые конкурируют за те же пулы киназ, что приводит к увеличению количества неполных комплексов каркасов для каждого каркаса и, следовательно, к менее эффективным. сигнализация в целом. Точно так же истощение каркаса A может даже способствовать передаче сигналов, опосредованной каркасом B, за счет уменьшения конкуренции за те же киназы и тем самым увеличения количества полных комплексов каркаса B.

Таким образом, можно предположить, что, контролируя флуктуации концентраций каркаса, биологическая система найдет эффективный режим для регулирования выходного сигнала MAPKs. Следовательно наклонная экспрессия каркасов вверх или вниз может быть действенным средством ослабления сигналов MAPK. Примечательно, что экспрессия большинства белков каркаса довольно стабильна и не подвержена серьезным немедленным изменениям в ответ на внешние стимулы и другие факторы, которые управляют активацией MAPKs. Здесь интригующий аспект белков каркаса ERK заключается в том, что истощение или избыточная экспрессия любого из них оказывает драматическое влияние на общую интенсивность сигнала ERK (например, при мутациях или амплификации).

Так, стимуляция клеток с помощью EGF загружает B-Raf в KSR1 каркас, также ERK локализуется в этом комплексе и после этого фосфорилируется. Когда стыковка ERK нарушается мутацией, комплекс KSR1-MEK-B-Raf сохраняется даже после стимуляции, в то время как в противном случае почти весь B-Raf покинул бы комплекс. И KSR1, и B-Raf являются мишенями фосфорилирования по обратной связи для ERK, и эти обратные связи усиливаются за счет стыковки ERK. Это фосфорилирование, по-видимому, связано с диссоциацией сигнального комплекса, поскольку показано, что опосредованное ERK фосфорилирование по обратной связи предотвращает устойчивую передачу сигналов ERK.

Т.о. каркасы не только обеспечивают платформу, на которой может происходить передача сигналов, но также регулируют пространственную и временную передачу сигналов MAPK путем направления сигнала в специфические субклеточные компартменты. Например, β-аррестин 2 в основном направляет ERK1 / 2 к ямкам, покрытым клатрином, а Sef захватывает активированный ERK в аппарате Гольджи, предотвращая ядерную транслокацию, но позволяя фосфорилировать субстраты в цитоплазме.
Другой пример - KSR1 (см. выше), который может перемещаться динамически: в покоящихся клетках KSR1 изолируется цитоплазмой. При стимуляции KSR1 перемещается к мембране клетки для облегчения передачи сигналов MAPK, приводя MEK в тесный контакт с его киназой Raf.

Вообще, стержневой концепцией теории каркасов является то, что для любого заданного каркаса существует оптимальная концентрация, которая дает максимальную эффективность сигнала, приводящую к колоколообразной кинетике активации MAPK. В этом процессе субоптимальная активация MAPK происходит как тогда, когда нет достаточных каркасов для объединения всех доступных MAPK, MAPKK и MAPKKK, так и когда чрезмерная концентрация каркасов разбрасывает MAPK, MAPKK и MAPKKK в неполных каркасах, что приводит к непродуктивности комплексов. Это явление получило название «комбинаторное торможение» и «эффект прозоны». Также каркас, который объединяет MEK и ERK, при высоких уровнях экспрессии будет образовывать в основном комплексы только с MEK или только ERK, но только несколько комплексов с MEK и ERK.

В случае каркасов для пути ERK ассоциации между различными объектами были продемонстрированы для: IQGAP1 и MP1, MP1 и MORG1, IQGAP1 и β-аррестина2, паксиллин и GAB1. И такое взаимодействие кажется важным для определенных клеточных процессов. Например, связь между IQGAP1 и MP1, по-видимому, имеет решающее значение для регуляции динамики очаговой адгезии во время клеточной миграции.
Регуляция пути PI3K/AKT с помощью каркасного белка NHERF1 (Na + /H + обменный регуляторный фактор 1) при стимуляции тромбоцитарным фактором роста (PDGF) является одним из наиболее изученных путей. Считается, что особенно слабые сигналы передаются только в присутствии каркасов, так как динамическое перемещение каркаса из цитоплазмы к рецептору на мембране увеличивает шанс успешной инициации сигнала.

NHERF1 может взаимодействовать как с AKT, так и с его негативными регуляторами PTEN и PHLPP. С-концевой хвост PTEN содержит PDZ-связывающий мотив, способный взаимодействовать с доменом PDZ1 NHERF1. NHERF1 связывается с PDGFRβ и рекрутирует PTEN в компартмент мембраны рядом с PDGFR, формируя каркас комплекса между PDGFRβ и PTEN. Этот тройной комплекс регулирует передачу сигналов PI3K/AKT в ответ на лиганд PDGF, избегая сверхактивации пути.
Так, взаимодействие PTEN-NHERF1 повышает стабильность белка PTEN и зависит от статуса фосфорилирования PTEN, поскольку фосфорилирование PTEN уменьшает его привлечение к плазматической мембране. Обычно PTEN деградирует с помощью убиквитинового протеасомного пути, но взаимодействие PTEN-NHERF1 предотвращает связывание PTEN с NEDD4, убиквитин-E3 лигазой, тем самым предотвращая убиквитин-зависимую деградацию PTEN.
Также β-Catenin является хорошо зарекомендовавшим себя партнером NHERF1, который может действовать как позитивный регулятор передачи сигналов Wnt, связываясь как с β-катенином, так и с TCF-1ß, образуя тройной комплекс, усиливающий активность этих факторов транскрипции.

[albert52]

Продолжим.

Каркасный белок KSR1 (киназный супрессор Ras) также может направлять сигналы в цитоплазму: помимо связывания Raf и MEK, KSR1 (но также и другие каркасы, такие как Sef и IQGAP1) помогает собирать димеры ERK1 / 2, которые необходимы для взаимодействия ERK с цитоплазматическими субстратами. Например, большие количества cPLA 2 , цитоплазматического субстрата ERK1 / 2, были связаны с KSR1 после стимуляции EGF. Поскольку одновременное связывание cPLA 2 и каркаса с ERK2 было бы стерически маловероятным, и поскольку известно, что ERK гомодимеризуется при активации, текущая модель состоит в том, что димеры ERK образуются там, где одна молекула ERK2 связана с cPLA 2, в то время как другая привязана к KSR1.

Механизм димеризации возникает, когда фосфорилированный мономер ERK, связанный с каркасом, взаимодействует со свободным мономером фосфо-ERK, который, вероятно, высвобождается из комплекса MEK-ERK. Эти димеры специфически фосфорилируют субстраты ERK в цитоплазме.
Были предложены альтернативные пути для фосфорилированных мономеров ERK, включая транслокацию в ядро ​​для фосфорилирования факторов транскрипции или свободное димеризацию в цитоплазме с последующим перемещением в ядро. Следовательно, KSR1 может контролировать, активируются ли субстраты в ядре или цитоплазме. Другие белки, которые, как известно, взаимодействуют с KSR, включают 14-3-3, G-белок-βγ, белки теплового шока 70 и 90, cdc37 и C-TAK1. Интересно, что MEK конститутивно связан с KSR, тогда как ERK связывается только в ответ на стимул. Как это типично для скаффолдов, оптимальные уровни экспрессии KSR необходимы для максимального ответа MAPK на сигнальные сигналы.

Роли каркасов, таких как KSR1, могут быть очень разными в разных типах клеток, а экспрессия каркасов клеточного типа и тканеспецифическая может играть важную роль в приписывании различных функций передаче сигналов MAPK в разных тканях.

Принятие клеточных решений включает в себя способность реагировать на постоянно меняющийся стимул определенным ответом - да или нет. Причиной переключающегося поведения может быть крутой профиль реакции на стимулы, описываемый как сверхчувствительность, но это также может быть бистабильность, когда система переключается из одного устойчивого состояния в другое. Наличие каркаса может увеличить вероятность возникновения бистабильности, особенно когда сродство субстрата и модифицирующего фермента низкое.

Сверхчувствительные ответы полезны, поскольку они позволяют отфильтровывать шум и энергично реагировать на соответствующие стимулы. Предположительно, сверхчувствительные ответы генерируются механизмами, которые встроены в структуру сигнальной сети и могут быть видны уже на уровне соответствующего MAPK. В общем, многоступенчатые процессы (де) активации могут вызывать устойчивые сверхчувствительные ответы. Примерами являются активация киназы несколькими последовательными событиями фосфорилирования, а также насыщение фермента путем ступенчатого связывания лигандов с положительной кооперативностью.
Теоретически трехуровневый каскад MAPK, включающий одиночное фосфорилирование Raf и двойное фосфорилирование MEK и ERK, по своей природе сверхчувствителен, и критическим детерминантом этого свойства является предполагаемый распределительный механизм (де) фосфорилирования. В конечном счете, дифференцированный ответ может быть результатом непосредственной близости каркасов, занятых по-разному, из-за локализации на мембране. Киназы, находящиеся на разных каркасах, затем могут транс-активировать друг друга.

Передача сигналов EGF инициируется в нанокластерах Ras-GTP, которые состоят примерно из 7 молекул Ras-GTP со временем жизни около 0,4 с и которые привлекают Raf к мембране. Показано, что каждый нанокластер действует как молекулярный переключатель, который преобразует ступенчатый вход в ответ «все или ничего». Однако, поскольку количество кластеров линейно увеличивается со стимулом, интегральный ответ по всем кластерам градуируется, давая линейный ответ фосфорилирования ERK на стимуляцию EGF.
Такие градуированные профили стимула-ответа часто наблюдаются в клетках млекопитающих, при этом свойства профиля сигнал-ответ не определяются на уровне каркаса. Например, измерения фосфорилирования ERK в клетках показывают, что путь MAPK может показывать ступенчатый ответ на стимуляцию хемокином SDF-1 или линейный ответ, когда задействован рецептор Т-клеток; на характер ответа обоих путей не влияет уровень экспрессии KSR1.

Что касается непосредственно пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), то некоторые факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулин, нейротрофины и воспалительные цитокины активируют MAPK. Клетки стимулируются этими факторами и реагируют на изменения в окружающей среде посредством манипулирования передачей сигналов MAPK. У млекопитающих идентифицировано пять различных групп МАРК. Это киназа MAPK/ERK/внеклеточно регулируемая киназа (MEK/ERK), N-концевая киназа c-Jun (JNK), p38, ERK5 и ERK3. МАРК могут контролировать как события в ядре, такие как регуляция генов, так и внеядерные события, такие как реорганизация цитоскелета, посредством фосфорилирования и активации мишеней в цитозоле и ядре.

Наиболее охарактеризованным из путей MAPK является каскад MEK/ERK. Будучи активными, ERKs димеризуются и либо перемещаются в ядро, где они фосфорилируют факторы транскрипции, либо остаются в цитозоле, где они фосфорилируют субстраты во многих клеточных компартментах. Преобладающими последствиями передачи сигналов MEK/ERK являются пролиферация или дифференцировка.

IQGAP1 является большим, широко экспрессируемым белком , который регулирует многие сигнальные пути и клеточные функции. Имея несколько доменов, IQGAP1 способен связываться с широким спектром белков, тем самым модулируя динамику актина, динамику микротрубочек, межклеточную адгезию и регуляцию транскрипции. IQGAP1 является каркасом для каскада MAPK. IQGAP1 связывается непосредственно с B-Raf, MEK1, MEK2, ERK1 и ERK2 и регулирует их активацию в ответ на EGF и CD44. Кроме того, у мышей выработка условного рефлекса страха увеличивает ассоциацию IQGAP1 с активным ERK2.
Аналогично KSR, как увеличение, так и снижение уровня экспрессии IQGAP1 осла***ют EGF-зависимую активацию MEK и ERK, указывая на то, что правильная стехиометрия компонентов IQGAP1 и MAPK необходима для эффективного распространения каскада. IQGAP1 преимущественно активирует сигнальный путь MEK1 и было высказано предположение, что MEK1 способствует пролиферации, тогда как MEK2 способствует дифференцировке и поэтому IQGAP1 может регулировать клеточный ответ на передачу сигналов MAPK. Что же касается B-Raf, то, например, нокаут IQGAP1 из клеток делает B-Raf нечувствительным к стимуляции EGF, предполагая, что IQGAP1 действует «выше» B-Raf и необходим для активации B-Raf факторами роста.

IQGAP1 является регулятором актина и цитоскелета микротрубочек, и заманчиво предположить, что IQGAP1 связывает передачу сигналов MAPK с динамикой цитоскелета. Отметим, что как IQGAP1, так и ERK2 локализуются в микротрубочках, ассоциированных с белком-2 в нейрональных клетках. Кроме того, IQGAP1 образует комплекс с CD44, Cdc42 и актином в ответ на гиалуронан, а также необходим для гиалуронан-зависимой активации ERK и Elk.

MEK partner-1 (MP-1), широко экспрессируемый каркас для пути MEK/ERK; чтобы усилить передачу сигналов MAPK в клетках, MP1 необходимо присутствие взаимодействующего с ним белка p14, который локализует MP1 в эндосомах. И MP1, и p14 необходимы для EGF-зависимой активации ERK.

β-аррестины являются хорошо известными регуляторами GPCR. После активации рецептора β-аррестин вызывает диссоциацию гетеротримерного G-белка, что нацеливает GPCR на ямки, покрытые клатрином. Также активный Src рекрутируется на β2-адренергические рецепторы посредством прямого взаимодействия с β-arrestin. Здесь Src фосфорилирует адапторный белок Shc, что приводит к активации Grb2 и, следовательно, активации каскада MAPK (см. выше).
Также в ответ на активацию рецептора протеазой (PAR), β-аррестин рекрутирует Raf, MEK и ERK к рецептору, усиливая активацию ERK. Эти комплексы сопровождают рецептор к ранним эндосомам, способствуя эффективной передаче сигналов MAPK. Важно отметить, что β-аррестин предотвращает транслокацию активной ERK в ядро, ограничивая ERK цитозольными субстратами .

Также каркасный белок Sef захватывает активные комплексы MEK/ERK в Golgi и ингибирует диссоциацию комплекса MEK/ERK; следовательно, Sef ингибирует ядерную локализацию ERK и ограничивает ERK цитозольными субстратами. Sef является ингибитором передачи сигналов FGF; интересно, что в отличие от его роли в передаче сигналов FGF, Sef увеличивает продолжительность EGF-зависимой активации ERK. Поэтому возможно, что Sef регулирует передачу сигналов MAPK от факторов, отличных от EGF и FGF.

[albert52]

Продолжим.

В покоящихся клетках KSR1 конститутивно взаимодействует с MEK1 / 2 и PP2A (протеинфосфатазой 2, дающей большую долю фосфатазной активности в эукариотических клетках), а комплекс KSR1-MEK-PP2A сохраняется в цитозоле благодаря его взаимодействиям с 14-3-3 и Ras-чувствительная E3-убиквитинлигаза препятствует распространению митогенного сигнала (IMP).

Каркас MP1-p14 участвует в PAK1-зависимой активации ERK во время адгезии и миграции клеток. MP1-p14-опосредованная активация ERK необходима для подавления сигнальной оси ROCK (RH-ассоциированной спирально-содержащей протеинкиназы, что является дополнительным условием для адгезии и миграции клеток. С другой стороны, каркас MP1 является необязательным для ответа ERK, активированного тромбоцитарным фактором роста (PDGF).

Скаффолд MORG1, может связываться с Raf-1, B-Raf, MEK1, MEK2, ERK1 и ERK2. Роль MORG1 в передаче сигналов ERK, по-видимому, специфична для лигандов / рецепторов; похоже, что MORG1 участвует в облегчении передачи сигнала от рецепторов, связанных с G-белком, таких как рецепторы LPA (лизофосфатидиновой кислотой), но не от рецепторных тирозинкиназ (RTK).

Контекстно-специфичные каркасы для модуля ERK обеспечиваются цитоскелетным белком паксиллином во время морфогенеза эпителиальных клеток, опосредованного фактором роста гепатоцитов (HGF). Паксиллин представляет собой белок 68 кДа, расположенный в фокальных адгезиях в ассоциации с другими специфическими для фокальной адгезии белками, такими как винкулин, ФАК, актопаксин и ПАК.
В покоящихся клетках паксиллин конститутивно связан с MEK, однако в клетках, стимулированных HGF, Src-опосредованное фосфорилирование паксиллина приводит к рекрутированию неактивного ERK. Впоследствии активированный Raf связывается с паксиллином, тем самым активируя связанные MEK и ERK, а ERK вовлекается в комплекс фокальной адгезии для передачи сигналов другим сигнальным белкам, таким как киназа фокальной адгезии (FAK ), облегчая рекрутирование FAK в комплексы фокальной адгезии для быстрого обновления. Таким образом, paxillin обеспечивает эффективный каркас для модуля ERK для организации сигнального узла в непосредственной близости от фокальных адгезий, чтобы способствовать миграции клеток посредством передачи сигналов ERK.

Мембранная челночная киназа MEKK1 представляет собой MAP3K, участвующую в активации модулей ERK и JNK; она может физически ассоциироваться с компонентами трехуровневого модуля ERK, а именно Raf-1, MEK1 и ERK2 в дополнение к Ras. Эти киназы тесно выровнены на поверхности каркаса, предоставленной MEKK1; коэкспрессия конститутивно активного мутанта MEKK1 стимулирует фосфорилирование MEK1 и MEK2. Помимо области каркасного белка MAP3K1 содержит домен протеинкиназы и цинковый палец PHD (который имеет структуру, подобную домену пальца RING ), который служит в качестве убиквитинлигазы E3.

Есть также несколько других белков, таких как CNK1, CNK2 и 14-3-3, которые могут взаимодействовать с различными компонентами модуля ERK, вызывая специфический для контекста ответ. Например, CNK1, по-видимому, участвует в Src-опосредованной активации Raf-1, необходимого для полной активации Raf-1. В случае CNK2 было показано, что он обеспечивает специальный сигнальный канал для опосредованной NGF (фактором роста нервов) активации модуля ERK. Белок 14-3-3 привязывает передачу сигналов киназы С (PKC) к Raf в дополнение к его модуляторной роли в каркасах KSR и PEA-15 (эндосомальный фосфопротеин), и, по-видимому, опосредует цитоплазматическую секвестрацию ERKs.
Поскольку эти каркасные белки не взаимодействуют со всеми компонентами трехуровневого киназного модуля, можно утверждать, что они сами по себе не образуют «настоящие» функциональные каркасы. Тем не менее, возможно, что они могут действовать как «вложенные скаффолды» в тандеме или в сотрудничестве с другими каркасными белками при передаче сигналов ERK.

В зависимости от субклеточной локализации, из которой исходят активирующие сигналы, определенные каркасы определяют, какие субстраты могут быть фосфорилированы. Как уже упоминалось, три уровня сигнального каскада MAPK первоначально активируются на плазматической мембране. Однако на более поздних стадиях комплексы присутствуют в эндосомах, что необходимо для достижения правильного сигнального ответа. По-видимому, эндоцитоз активированных рецепторов и связанных с ними сигнальных комплексов имеет решающее значение для максимальной активации MAPK, а активированные Ras, C-Raf, MEK1 и ERK1 могут быть обнаружены в эндосомах.
Эндоцитоз может способствовать более контролируемому пространственно-временному разрешению сигнального каскада. Кроме того, он также может защищать сигнал при передаче на большие расстояния, тогда как медленная диффузия белка и быстрое дефосфорилирование белка могут мешать ему.

Взаимодействие MP1 с p14 оказалось важным для локализации каркасного комплекса MP1-MAPK в поздних эндосомах / лизосомах во время второй устойчивой фазы передачи сигналов MAPK, при этом p14 взаимодействует с MEK1 и ERK1 только косвенно через MP1. Вообще, передача сигналов MAPK, ассоциированная с эндосомами, может играть роль в регуляции биогенеза эндосом и лизосом. Эндосомной локализации комплексов MP1 / p14 способствует небольшой адаптерный белок p18, который связан с липидными рафтами.
Более подробный анализ выявил роль специфических компартментов плазматической мембраны в передаче сигналов MAPK. Например, кавеолы обогащены многими сигнальными рецепторами, такими как EGFR, VEGFR2, p75 NTR и TrkA. Эти мембранные компартменты обеспечивают некоторую степень спецификации сигнала, регулируя активацию MAPK в ответ на специфические стимулы. Так, многие компоненты передачи сигналов MAPK, включая Shc, Grb2, Sos и Ras, были обнаружены в эндосомах, содержащих EGFR; эндосомы т.о. действуют как сигнальные платформы, обеспечивая распространение каскадов MAPK.

Белки Ras локализуются как в аппарате Гольджи, так и в эндоплазматическом ретикулуме (ER). Интересно, что в то время как активация H-Ras, зависящая от фактора роста, как на плазматической мембране, так и на ER происходит быстро, в течение 1 минуты и полностью прекращается через 20-40 минут, активация H-Ras в аппарате Гольджи задерживается, занимая 10 минут и сохраняется в течение 60 минут.
Будучи привязанным к аппарату Гольджи, конститутивно активный Ras, RasQ61L, является сильным активатором ERK и протеинкиназы Akt, но слабо активирует JNK. Наоборот, будучи привязанным к ER, Ras61L сильно активирует JNK, в то время как лишь слабо активирует ERK и Akt.

Что касается онкогенеза, то IQGAP1, например, активируется за счет амплификации гена при некоторых диффузных типах карциномы желудка, а также сверхэкспрессируется при колоректальной карциноме, особенно на фронте инвазии. Транслокация IQGAP1 из цитоплазмы на клеточную мембрану, которая ингибирует E-кадгерин-опосредованную межклеточную адгезию, коррелирует с дисфункцией E-кадгерина и дедифференцировкой опухоли при карциноме желудка. IQGAP1 и кальмодулин, вероятно, играют важную роль в метастазировании.
Потеря экспрессии Sef коррелирует с метастатическим раком простаты высокой степени злокачественности. Кроме того, посредством взаимодействия с c-Src, β-arrestins модулируют трансактивацию EGFR простагландином E2 в клеточных линиях колоректальной карциномы; взаимодействие между β-аррестином и c-Src имеет решающее значение для миграции клеток колоректальной карциномы in vitro и метастазирования in vivo.

[albert52]

Продолжим о каркасных белках

В пути ERK различная кинетика активации может определять разные клеточные судьбы. Эта кинетическая информация расшифровывается в дифференциальные биохимические реакции посредством дифференциальной стабилизации или активации факторов транскрипции или сборки различных белковых комплексов. Но в целом передача сигнала требует координации действий между различными путями и фундаментальный вопрос заключается в том, как сигнальные сети генерируют конкретные решения.

Сигнальный путь Hippo включает многочисленные белки, которые регулируют размер и форму органов, регенерацию и биологию стволовых клеток. Путь Hippo отвечает на несколько стимулов, таких как стресс, нарушение полярности клеток и сигналы адгезии, и участвует в онкогенезе. Основными компонентами этого каскада являются модуль киназы и модуль транскрипции.

Центральные компоненты пути Hippo включают основную киназную кассету, состоящую из Ste20-подобной киназы 1/2 млекопитающих (MST1/2) и большой киназы-супрессора опухолей 1/2 (LATS1/2); и нижележащие транскрипционные коактиваторы Yes-associated protein (YAP) и коактиватор с PDZ-связывающим доменом (TAZ). MST1/2 фосфорилирует и активирует LATS1/2, который впоследствии фосфорилирует YAP и TAZ. Функциональная активность фосфорилированных YAP и TAZ ингибируется путем секвестрации в цитоплазме белками 14-3-3 и/или протеасомной деградации. Также семейство белков ангиомотина (AMOT) связывается с YAP и способствует его удержанию в цитоплазме.

Когда путь Hippo отключен, нефосфорилированный YAP перемещается в ядро ​​и действует как коактиватор факторов транскрипции. YAP в основном взаимодействует и регулирует ассоциированный домен факторов транскрипции TEAD 1/2/3/4, чтобы индуцировать транскрипцию набора генов, которые способствуют пролиферации клеток и ингибируют апоптоз.

Путь Hippo содержит два каркасных белка, SAV1 (сальвадор белок 1), содержащий домен WW семейства, и активатор киназы MOB 1 (MOB1), которые образуют основной киназный комплекс, ингибирующий YAP, первичный эффектор пути. В н***агоприятных условиях роста MST1/2 связывается с SAV1 и MOB1, фосфорилируя их, образуя комплекс SAV1–MST1/2–MOB1. В дополнение к своей роли каркаса для MST1/2, SAV1 рекрутирует MST1/2 на мембрану, где он активирует LATS1/2, и для этой регуляции необходимо взаимодействие SAV1- NF2 (нейрофиброматоз II типа). Mob1, будучи фосфорилированным с помощью MST1 / 2, связывается с аутоингибирующим мотивом в Lats1 / 2, выключая его, что, в свою очередь, приводит к образованию петли активации Lats.

Еще один каркасный белок CORO7 локализуется в цитозоле и сети транс-Гольджи, где он регулирует организацию актинового цитоскелета, морфологию Гольджи и транспортировку белков после Гольджи. Повреждение актинового цитоскелета активирует путь Hippo через фосфорилирование LATS1/2 при содействии CORO7, который действует как каркас для LATS1, помогая ему взаимодействовать с SAV1 и MST2. При этом CORO7 может играть защитную роль для LATS1 с точки зрения стабильности белка.

В целом CORO7 взаимодействует с подмножеством компонентов пути Hippo, включая LATS1, MST2 и SAV1, при этом SAV1 может опосредовать связывание MST2 с CORO7. Тирозинкиназа Src ингибирует путь Hippo посредством фосфорилирования CORO7 по остаткам тирозина, т.е. является вышестоящим регулятором CORO7, который является критическим каркасным белком в пути Hippo. При этом Src активируется за счет адгезии клеток к внеклеточному матриксу, который, как известно, служит восходящим сигналом, ингибирующим путь Hippo.

IQGAP1 является каркасом в нескольких сигнальных каскадах, которые интегрируются с передачей сигналов Hippo. Например, IQGAP1 связывается с AKT и модулирует его активность: AKT фосфорилирует YAP по Ser 127 и индуцирует его взаимодействие с 14-3-3 в клетках, стимулированных EGF. Следовательно, IQGAP1 может регулировать зависимую от фосфорилирования локализацию YAP в ответ на специфические сигналы, такие как EGF-индуцированная активация AKT.

Путь Hippo т.о. не функционирует изолированно, а тесно интегрирован с путями Raf/MEK/ERK (кратко путь ERK) и Akt на разных уровнях их перекрестных связей. Первый уровень перекрестных связей проходит через Akt, который фосфорилирует MST2 и одновременно ингибирует его функциональную активность по отношению к LAST1, так как Akt-опосредованное фосфорилирование MST2 усиливает его связывание с Raf-1, что препятствует димеризации и активации MST2, и в то же время подавляет активацию Raf-1/ERK, изолируя Raf-1 от комплекса Ras/Raf-1.
Следующим уровнем перекрестных связей является LATS1-опосредованное фосфорилирование Raf-1 по серину 259, который затем неактивен по отношению к пути ERK, а его дефосфорилирование является центральной частью физиологического процесса активации Raf-1. С другой стороны, фосфорилирование Serine 259 способствует связыванию Raf-1 с MST2 и его ингибированию.

Akt в целом может играть противоположные роли в регуляции активности ERK, которые переключаются дозозависимым образом: Akt действует как промотор, когда его уровни низкие, и как ингибитор, когда его уровни высоки. Так, увеличение Akt, начиная с низкого уровня, фосфорилирует и ингибирует MST2, тем самым осла***я отрицательную обратную связь LATS1-Raf-1, что приводит к повышению активности Raf-1/ERK (фаза I). Однако дальнейшее увеличение Akt способствует накоплению неактивной формы MST2, которая изолирует Raf-1 от активации Ras посредством образования комплексов MST2-Raf-1, что приводит к подавлению активности ERK.

Клетки различного тканевого происхождения (или от разных пациентов) могут демонстрировать значительные различия в экспрессии компонентов этой сигнальной сети. Также очевидно, что уровни экспрессии белка могут значительно изменяться в клетках, несущих генетические изменения, такие как амплификация генов, мутации или эпигенетические модификации, по сравнению с нормальными клетками. Давно известно, что петли обратной связи создают динамику сложных и нелинейных систем.

Ожидается, что перекрестные связи и взаимодействия обратной связи между путями MST2 и ERK будут играть важную роль в определении динамического поведения всей сети. В целом сеть Hippo-ERK может генерировать очень разнообразные динамические профили, которые можно сгруппировать в несколько различных моделей доза-реакция для активных MST2 и ERK .

[albert52]

Продолжим.

Регуляция активности ERK1/2 в ядре и цитоплазме сложна, так как сплайс-изоформа p38MAPK-альфа, взаимодействующfy с белком Max (Mxi-2), может связывать ERK1/2 и обеспечивать его транслокацию в ядро, а также предотвращать дефосфорилированиe ERK1/2 в ядре фосфатазами MAPK-1 (MKP1) и DUSP5 (вероятно, в конечном итоге будет доказано, что большинство фосфатаз являются генами-супрессорами опухолей). Это позволяет активированной ERK1 /2 фосфорилировать транскрипционный фактор c-Myc и другие важные субстраты. Примечательно, что около половины идентифицированных в настоящее время субстратов ERK1/2 являются ядерными белками и участвуют в регуляции многих стимулированных ядерных процессов.

В ядре ERK может фосфорилировать факторы транскрипции, такие как: Elk-1, рецептор эстрогена (ER), Fos, глобиновый фактор транскрипции 1 (Gata-1), c-Myc, сигнальный трансдукционная активация транскрипции 1 и 3 (STAT1 и 3) и др . Эти факторы транскрипции связывают промоторы многих генов, включая гены факторов роста и цитокинов, которые важны для стимуляции роста и предотвращения апоптоза многих типов клеток.
ERK также может фосфорилировать и модулировать активность факторов транскрипции Twist, Snail, Slug и Zeb1 прямо или косвенно, которые могут регулировать клеточную пролиферацию, выживание, а некоторые могут модулировать эпителиально-мезенхимальный переход (EMT). Фосфорилирование факторов транскрипции с помощью ERK1/2 или, в некоторых случаях, родственной MAPK, p38MAPK, предотвращает их убиквитинирование и приводит к их стабилизации и повышению активности в ядре и способности стимулировать EMT.

В ядре ERK также может фосфорилировать митоген и стресс-активируемые протеинкиназы (MSK), которые, в свою очередь, могут фосфорилировать TF, такие как активатор транскрипционного фактора-1 (ATF-1), который важен для регуляции активности многих ранних генов после стимуляции митогенами/факторами роста (активируются AP-1).
MSK также фосфорилируют многие белки, участвующие в модуляции структуры хроматина, включая: гистон H3 и (белок-14 группы высокой подвижности) HMG14, что может привести к транскрипции немедленных ранних генов (IEG). Быстрая транскрипция IEG после стимуляции требует активации их факторов транскрипции в течение нескольких минут после стимуляции, и это происходит в основном с помощью быстро перемещаемой ERK1/2.
Одним из наиболее хорошо изученных факторов транскрипции, активируемых ERK1/2, является ядерный домен ETS, содержащий Elk1. Одним из самых ранних транскрипционных событий, регулируемых Elk1, при стимуляции является индукция IEG c-Fos, которая важна для правильного развития пролиферации и дифференцировки. Подобное фосфорилирование с помощью ERK1/2, по-видимому, важно для стабильности и активности других IEG, таких как c-Myc и Fra1.
ERK1/2 может также фосфорилировать многие белки, важные для структуры/реорганизации цитоскелета.

Функция, которую Akt играет в регуляции активности ERK, критически зависит от баланса между Ras и LATS1. Увеличение Akt истощает активный MST2, тем самым осла***я обратную связь LATS. Одновременно накопленный неактивный MST2 секвестрирует Raf-1 посредством их связывания, что приводит к снижению активности Raf-1 и, следовательно, активности ERK (см. выше). В целом Akt играет критическую роль в координации противоположной активности сигнальных осей Hippo и ERK, т.о. хотя Akt всегда ингибирует активность MST2, его дозоспецифическая функция по отношению к ERK предполагает, что Akt обладает способностью независимо настраивать одну сигнальную ветвь, не влияя на другую.

Что же касается Ras, то поскольку Ras находится непосредственно перед Raf-1, естественно ожидать, что увеличение содержания Ras приводит к увеличению активности ERK.
Переключение в отношении MST2 («выключено») и активности ERK («включено») происходило при разных пороговых значениях Ras, что предполагает, что в зависимости от концентрации Ras система может включать только MST2 (низкий Ras), только ERK ( высокий Ras), или оба (промежуточный Ras). Таким образом, Ras оказывает многофункциональное действие в зависимости от его содержания.
Вообще после активации некоторые пути MAPK достигают критического уровня силы сигнала и ведут себя подобно переключателям. Следовательно, отдельные клетки в популяции будут либо «включены», либо «выключены» по отношению к конкретному результату. Другие пути реагируют ступенчато, когда все клетки в популяции демонстрируют равномерное увеличение «выходного сигнала», пропорциональное активирующему стимулу.

Сам путь Raf/MEK/ERK проявляет свойства усилителя отрицательной обратной связи (NFA). По сути, передача сигналов NFA аналогична по биологическому устройству тем, которые используются в электронных схемах. NFA в электронных схемах оптимизируют надежность, стабилизацию сигнала и линеаризацию нелинейного усиления сигнала. Эти свойства Raf/MEK/ERK NFA важны для определения кинетики активации, реакции на лекарства и различных других последующих эффектов активированной ERK.

МАРК-модули состоят из трех отдельных киназ, а именно, MAP-киназной киназы (MAP3K), MAP-киназной киназы (MAP2K) и нижестоящей MAPK. Из наблюдения, что непропорционально большое количество MKKKs присутствует в клетках млекопитающих для регуляции ограниченного количества MAPKs , было сделано заключение, что белки каркаса облегчают специфичную для контекста сборку различных MAP3K, MAP2Ks и MAPKs. На сегодняшний день идентифицировано девять различных модулей MAPK. Это ERK1 / 2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6 / p38MAPK γ , ERK7, ERK8, JNK1 / 2/3 и p38MAPK α / β / δ; многие из каркасных белков, идентифицированных на сегодняшний день, участвуют в регуляции этих модулей.

Подсемейства JNKs и p38s участвуют в реакции на клеточные события, такие как воспаление, инфекция и стресс окружающей среды. Считается, что белок-белковые взаимодействия имеют решающее значение для нормальной функции сигнального пути JNK. Так, были идентифицированы каркасные белки для группы JNK МАРК. К ним относится группа предполагаемых каркасов JNK-взаимодействующих белков (JIP). Белки JIP1 и JIP2 являются близкородственными белками, которые связываются с JNK, MKK7 и протеинкиназами смешанного происхождения. Они наиболее сильно экспрессируются в инсулин-секретирующих β-клетках поджелудочной железы и в нейронах и, как предполагается, регулируют экспрессию гена инсулина и гена переносчика глюкозы GLUT2.
Исследования гена Jip1 человека привели к выявлению миссенс-мутаций, которые сегрегируют с диабетом II типа; можно предположить, что JIP1 регулирует апоптоз β-клеток поджелудочной железы.

Отметим, что связанный модуль JNK не будет функционировать для усиления сигналов. Вместо этого сборка модуля JNK каркасным белком может привести к эффективной активации JNK в ограниченной области клетки с помощью определенного стимула. Возможна также динамическая регуляция субклеточной локализации каркаса. Еще недавние исследования установили, что актин-связывающий белок филамин может функционировать в качестве предполагаемого каркаса для сборки модуля цитокинового рецептора, который активирует JNK; филамин взаимодействует с MKK4 и TRAF2.

Cуществует множество каркасных/шаперониновых белков, которые взаимодействуют с различными компонентами каскада Raf/MEK/ERK, например , 14-3-3, MP-1, белок теплового шока-90 (HSP-90), KSR, RKIP (ингибирующий белок киназы Raf). Белки теплового шока, такие как HSP-90, считаются сторожами, поскольку они обычно служат для защиты активности белков-клиентов. Мутации в KRAS придают чувствительность к ингибиторам HSP-90, таким как гелданамицин, что подтверждает важность HSP-90 в регуляции этого пути.

RKIP также считается геном-супрессором метастазирования при некоторых видах рака и обладает эффектами привратника и сторожа. Было показано, что активация Raf-1 с помощью Ras зависит от белка-прогибитина, повсеместно экспрессируемого белка, который также может служить белком-шаперонином. Прогибитин , также известный как PHB , представляет собой белок , кодируемый у людей геном PHB.

[albert52]

Продолжим.

Фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K) представляет собой гетеродимерный белок с регуляторной субъединицей 85 кДа и каталитической субъединицей 110 кДа ( PIK3CA ). PI3K служит для фосфорилирования ряда мембранных фосфолипидов. Чаще всего PI3K активируется посредством связывания лиганда с его родственным рецептором, в результате чего р85 связывается с фосфорилированными остатками тирозина на рецепторе через домен Src-homology 2 ( SH2). После ассоциации с рецептором каталитическая субъединица р110 затем переносит фосфатные группы на вышеупомянутые мембранные фосфолипиды. Именно эти липиды, особенно PtdIns(3,4,5)P3 , привлекают ряд киназ к плазматической мембране, тем самым инициируя сигнальный каскад.

Ниже PI3K находится первичная эффекторная молекула сигнального каскада PI3K, Akt/ протеинкиназа B (PKB); Akt активируется посредством фосфорилирования двух остатков: T308 и S473.
Фосфотидилинозитид-зависимые киназы ( PDK ) ответственны за активацию Akt . PDK1 является киназой, ответственной за фосфорилирование T308. Akt также фосфорилируется mLST8 (возможным PDK2), нечувствительным к рапамицину компаньоном комплекса mTOR / mTORC2. Следовательно, фосфорилирование Akt несколько затруднено, так как он фосфорилируется комплексом, расположенным ниже самого активированного Akt.

После активации Akt покидает клеточную мембрану для фосфорилирования внутриклеточных субстратов, а также способен перемещаться в ядро, где он влияет на активность ряда регуляторов транскрипции, например, CREB, E2F, NF-кВ (через IКК), транскрипционные факторы вилки и MDM2, который регулирует активность p53.

Главный ингибитор пути PI3K PTEN. Ген PTEN кодирует липидную и протеиновую фосфатазу, первичным липидным субстратом которой является PtdIns( 3,4,5 ) P3. Впрочем субстраты PTEN более разнообразны, включая киназу фокальной адгезии (FAK), обменный белок Shc и регуляторы транскрипции ETS-2 и Sp1, а также PDGFR.

Другим негативным регулятором PI3K-пути являются фосфатазы PHLPP (PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatases). PHLPP (PHLPP1 и PHLPP2) дефосфорилирует Ser-473 (гидрофобный мотив) в Akt, тем самым частично инактивируя киназу. Кроме того PHLPP может дефосфорилировать киназы AGC, такие как S6K и PKC на их гидрофобных мотивах, а также ингибирующий сайт проапоптотической киназы Mst1, что приводит к ее активации.
PHLPP способен подавлять ацетилирование и фосфорилирование гистонов, чтобы уменьшить экспрессию генов рецепторных тирозинкиназ, таких как EGFR. Кроме того, PHLPP1 дефосфорилирует RAF1, обеспечивая еще один путь подавления передачи сигналов MAPK .

Две другие фосфатазы, SHIP-1 (инозитол - 5'- фосфатаза, содержащая домен SH1) , и SHIP-2 удаляют 5-фосфат из фосфолипида PtdIns(3,4,5) P 3 с образованием PtdIns(3,4) P 2. Мутации этих фосфатаз, устраняющие их активность, также могут приводить к опухолевой прогрессии.

Как известно, главной функцией Akt является ингибирование комплекса TSC1/TSC2, блокирующего белок Rheb, связывающий/обменяющий GTP, который играет ключевую роль в регуляции mTORC1 и контроле эффективности трансляции белка.
В присутствии питательных веществ mTORC1 рекрутируется на поверхность лизосом с помощью RAPTOR и активированных Rag GTPases. Оказавшись на лизосомальной мембране, mTORC1 параллельно активируется Rag GTPases вместе с Rheb GTPase. Сама Rheb GTPase представляет собой точку регуляции, поскольку ее активность регулируется комплексом TSC1/TSC2, который управляет гидролизом GTP до GDP в Rheb, тем самым вызывая его инактивацию. Активность TSC1/TSC2 регулируется множеством сигналов окружающей среды, включая присутствие фактора роста и уровня энергии клетки.

Кстати Rheb является мишенью FTI (ингибиторов фарнезилтрансферазы), с помощью которой изопренильная группа добавляется к остаток цистеина. Это важный процесс, обеспечивающий белок-белковые и белок-мембранные взаимодействия. Эти ингибиторы были разработаны с целью нацеливания на Ras. К сожалению, клинические испытания ингибиторов FT (FTI) дали неутешительные результаты. Отсутствие полезности FTI может быть связано с несколькими причинами. Во-первых, есть много белков, которые регулируются FT. Во-вторых, хотя FT модифицирует чаще всего H-Ras и в меньшей степени K-Ras, N-Ras также может модифицироваться геранил - геранил - трансферазой (ГГТ). Этот модифицированный N-Ras по-прежнему способен поддерживать биологическую потребность в Ras в раковой клетке.
Но некоторый клинический эффект FTI был связан с блокадой Rheb. Дело в том, что Rheb располагается в различных эндомембранных структурах, включая ER и Golgi, причем обнаруживается в основном в цитозольной фракции, что свидетельствует о слабом взаимодействии с мембранами.
Фарнезилирование Rheb делает возможным его слабое взаимодействие с мембраной ER и что это временное и обратимое взаимодействие необходимо для активации mTORC1. В случае Rheb на мембранах Гольджи предполагается, что непосредственная близость с mTORC1 на лизосомальных мембранах опосредуется через взаимосвязанные поверхности между этими органеллами.

mTORC1 представляет собой S/T-киназу с молекулярной массой 289 кДа. Он регулирует трансляцию в ответ на питательные вещества и факторы роста путем фосфорилирования компонентов механизма синтеза белка, включая p70 S6K и эукариотический фактор инициации трансляции 4EBP-1 , последний приводит к высвобождению фактора эукариотической инициации-4E (eIF-4E), позволяя eIF-4E участвовать в сборке комплекса инициации трансляции.
mTOR контролирует несколько стадий, участвующих в синтезе белка, но, что также важно, усиливает продукцию ключевых молекул, таких как c-Myc, cyclin D1, p27 Kip1 и белок ретинобластомы (pRb). mTOR также контролирует трансляцию мРНК HIF-1α, активация которого приводит к увеличению экспрессии ангиогенных факторов, таких как VEGF и PDGF. Более того, HIF-1α регулирует гликолитический путь, контролируя экспрессию молекул, чувствительных к глюкозе, включая переносчики глюкозы Glut 1 и Glut3.

Многие из мРНК, кодирующих ранее упомянутые гены, содержат 5'- нетранслируемые области , которые богаты G+C и трудно транслируются и поэтому называются слабыми мРНК. 4EPB-1 образует комплекс с этими мРНК и др. связывающими факторами, что делает возможным трансляцию этих слабых мРНК. ERK, p90 Rsk-1 , MNK1/2 и p70S6K регулируют фосфорилирование многих белков, участвующих в ключевом комплексе, необходимом для трансляции слабых мРНК. Mcl-1 является примером слабой мРНК и играет ключевую роль в регуляции апоптоза. Ингибиторы рапамицина и киназы mTOR подавляют трансляцию этих критических мРНК, участвующих в выживании и росте клеток.

Недавние данные показали, что в солидных опухолях ингибирование mTORC1 приводит к активации ERK 1/2 посредством p70 S6K /PI3K/Ras/Raf/MEK. Также mTORC2 может функционировать как неуловимая PDK-2, которая фосфорилирует Akt на S473 в ответ на стимуляцию фактором роста. Предполагается, что между этими двумя комплексами существует равновесие; когда образуется комплекс mTORC1, это может препятствовать образованию комплекса mTORC2 и снижать активность Akt.

[albert52]

Вставка.
Регуляция биосинтеза белка

Регуляция необходима для поддержания баланса разнообразных белков в клетке или организме, для изменения этого баланса в меняющихся условиях окружающей или внутриорганизменной среды, для обеспечения смены белков в процессах клеточной дифференцировки и развития организма, для адекватного ответа на специфические внешние сигналы или н***агоприятные воздействия.
Живые клетки используют несколько различных способов или путей такой регуляции, но практически во всех случаях она осуществляется через регуляцию инициации трансляции. Это означает, что регуляторные механизмы трансляции направлены на то, чтобы разрешить или не разрешить инициацию трансляции данной мРНК, и если разрешить, то с какой эффективностью (скоростью инициации): чем больше скорость, тем больше образуется белка.

Существуют три основных способа, как регулировать трансляцию. Первый способ – позитивная регуляция на основе сродства мРНК к инициирующей рибосоме и факторам инициации (дискриминация мРНК (англ. discriminate — отличать, распознавать)). Второй способ – негативная регуляция с помощью белков-репрессоров, которые, связываясь с мРНК, блокируют инициацию (трансляционная репрессия). При этом белок-репрессор имеет специфическое сродство к участку мРНК в районе инициации трансляции (часто к участку с нестабильной вторичной структурой) и, связываясь с ним (и стабилизируя его), создает барьер либо для посадки инициирующих рибосомных частиц, либо для движения рибосомы к месту инициации.

Этими двумя способами регулируются индивидуальные мРНК, то есть трансляция каждой мРНК может специфически контролироваться независимо от других мРНК клетки. Третий способ – тотальная регуляция трансляции всей совокупности мРНК клетки посредством модификации факторов инициации. Отметим что при наличии общих черт регуляции на уровне трансляции у прокариотических (бактерии) и эукариотических организмов тотальная регуляция за счет модификации факторов инициации характерна, по-видимому, только для эукариот.

Скорость или частота инициации трансляции рибосомами может сильно различаться для разных мРНК. У прокариотических организмов это определяется тем, что инициирующие или рибосомосвязывающие участки разных мРНК имеют разное сродство к рибосомам и, таким образом, с разной эффективностью связывают рибосомные частицы. На основании разницы в эффективности инициации можно говорить о «сильных» и «слабых» мРНК. На сильных мРНК инициация происходит часто, на них нанизывается много рибосом (образуются плотные полирибосомы) и соответственно продуцируется много молекул белка. Редкая инициация трансляции на слабых мРНК дает в результате редкую посадку рибосом на эти мРНК и, следовательно, низкую белковую продукцию.

Как правило, если белок имеет четвертичную структуру, построенную из разных субъединиц в различном соотношении, то сила мРНК или ее отдельных участков (цистронов), кодирующих эти субъединицы, координирована с пропорцией субъединиц в структуре. Например, мембранный комплекс протонной АТФазы бактерий построен из трех типов субъединиц в соотношении 1:2:10 (a1b2c10), и соответственно субъединица c кодируется очень сильным цистроном мРНК, субъединица a – слабым, а субъединица b – цистроном промежуточной силы.

Похожая ситуация наблюдается и в эукариотических клетках, но там дискриминация мРНК обусловлена скорее разным сродством факторов инициации, а не самих рибосом к разным 5'-проксимальным инициаторным структурам мРНК. Так как факторы инициации в любом случае локализуются на инициирующих малых рибосомных субчастицах, то они и определяют разную эффективность посадки рибосом на разные мРНК.
Различная сила мРНК в значительной мере определяет соотношение продукции различных белков в клетке. Так, структурные белки мембран, рибосомные белки, факторы элонгации, белки оболочки вирусов и другие белки, требуемые в большом количестве, например, пищеварительные ферменты, кодируются сильными мРНК, а многие регуляторные белки – слабыми мРНК.

Трансляция контролируется с помощью большого количества механизмов, наиболее понятным из которых является фосфорилирование факторов трансляции и их регуляторов, особенно ключевых факторов инициации трансляции эукариот (eIFs). mTORC1-опосредованное фосфорилирование eIF4E-связывающих белков (4E-BP) и рибосомных киназ S6 (S6Ks) приводит к устойчивой эффективности инициации трансляции (см выше).

eIF4F представляет собой гетеромерный комплекс, который связывает структуру кэпа и состоит из eIF4A (РНК-геликазы), eIF4E (связывающего кэп белка) и eIF4G (каркасный белок), который связывает как eIF4E, так и eIF4A. После связывания с кэпом eIF4F раскручивает 5'-проксимальную вторичную структуру мРНК, чтобы облегчить связывание преинициативного комплекса 43S (который включает 40S рибосомную субъединицу). После сканирования вдоль 5'-UTR на предмет подходящего стартового кодона AUG, комплекс предварительной инициации затем растворяется, и рибосомная субъединица 60S присоединяется к субъединице 40S с образованием трансляционно компетентной 80S рибосомы.

Этому процессу способствует фактор eIF5B (5B), который инициирует удлинение трансляции. Фаза элонгации характеризуется добавлением аминокислот к растущему пептиду и транслокацией рибосом по мРНК, процессом, который частично контролируется фактором элонгации eEF2. Наконец, прекращение трансляции связано с высвобождением вновь синтезированного пептида и диссоциацией рибосомы от мРНК.

Для связывания инициаторной аминоацил-тРНК (Met-tRNAi) с малой рибосомной субчастицей в процессе инициации трансляции требуется eIF2 в комплексе с ГТФ (GTP); в ходе инициации ГТФ гидролизуется на ГДФ (GDP) и ортофосфат и eIF2 в комплексе с ГДФ (eIF2 : GDP) освобождается из рибосомы.
В норме дополнительный фактор eIF2В принимает участие в том, чтобы превратить отработанный (неактивный) eIF2 : GDP в необходимый для следующей инициации eIF2 : GTP. Этот фактор играет каталитическую роль в обмене ГДФ на ГТФ, и его в клетке мало. Когда eIF2 фосфорилируется фосфокиназой (eIF2Р), он может обычным образом участвовать в инициации трансляции, но, освободившись из рибосомы с ГДФ (в форме eIF2Р : GDP), он образует прочный комплекс с eIF2В (eIF2В : eIF2Р : GDP) и тем самым связывает весь eIF2В клетки, лишая последнюю возможности катализировать регенерацию eIF2 : GTP из eIF2 : GDP, тем самым подавляя синтез белка.

Механизмы трансляционной репрессии обеспечивают пути модуляции скоростей инициации трансляции в широких пределах либо в зависимости от внешних сигналов (эффекторов), либо по типу обратной связи, когда мРНК репрессируется своим же продуктом. Что же касается эффекторов, то, например, в животных клетках белок-репрессор блокирует инициацию синтеза белка ферритина, а железо в качестве эффектора лишает репрессор его мРНК-связывающих свойств и дерепрессирует ферритиновую мРНК, тем самым разрешая ее трансляцию.

Кроме типичной трансляционной репрессии эукариоты выработали механизм маскирования мРНК, когда соответствующая мРНК становится недоступной не только для инициации трансляции, но и фактически выведена из всех других процессов ее возможных превращений или изменений – деградации нуклеазами, ферментативной модификации ее 3'-конца путем полиаденилирования и пр.
Маскирование и демаскирование мРНК являются особенно характерными для процессов гаметогенеза (оогенеза и сперматогенеза), раннего эмбрионального развития, клеточной дифференцировки, гормонального включения или выключения функций. Например, в оогенезе происходит запасание некоторых материнских мРНК в маскированной форме, и часть этих мРНК демаскируется в ответ на оплодотворение яйцеклетки, обеспечивая белковый синтез на самых ранних стадиях эмбриогенеза: дробления, бластулы и ранней гаструлы.

Наиболее обычный путь тотальной регуляции белкового синтеза у эукариот, во всяком случае у животных и грибов, – это активация специальной фосфокиназы (eIF2Р), которая фосфорилирует фактор инициации eIF2, что приводит к подавлению инициации трансляции всех мРНК клетки (см. выше). Сигналами для активации фосфокиназы в клетке являются тепловой шок и другие виды стрессовых воздействий, недостаток ростовых факторов, аминокислотное голодание, недостаток железа, вирусные инфекции. Степень подавления белкового синтеза может варьировать в зависимости от уровня стресса.

Для многих локализующихся мРНК репрессия трансляции отменяется сразу после прибытия в конечный субклеточный пункт назначения. Субклеточное положение белка является ключевым фактором, определяющим его функцию. Локализующиеся мРНК упакованы в рибонуклеопротеидные комплексы (комплексы RNP), которые взаимодействуют с моторами цитоскелета для направленного транспорта по дорожкам цитоскелета, что является эволюционно консервативным механизмом для контроля локализации белка. При этом мРНК совместно собираются в мультимолекулярные транспортные единицы. Различные регуляторы трансляции, которые обнаруживаются в комплексах RNP, представляют собой челночные белки, которые содержат сигналы ядерной локализации и накапливаются, по крайней мере, временно в ядре.
Транспортные RNP могут иметь общие компоненты с процессинговыми тельцами (P-тельцами) - общими цитоплазматическими сайтами для подавления трансляции.

Локализованные мРНК впоследствии транслируются в ответ на локализованные сигналы. Синтез на месте придает белку новые сигнальные свойства и помогает поддерживать локальный протеомный гомеостаз.
Локализация РНК может быть эволюционно консервативным механизмом, который децентрализует геномную информацию и делегирует ее контроль субклеточным компартментам. Генетическая информация, закодированная в ядре, обеспечивает поставку мРНК путем транскрипции, из которой выбираются определенные наборы мРНК для субклеточной локализации. Т.о. субклеточные целевые коллекции мРНК могут функционировать как геномный форпост.

[albert52]

Вставка

Стрессовые гранулы

Стрессовые гранулы (SG) представляют собой разделенные по фазам биомолекулярные конденсаты РНК-связывающих белков (RBP) и мРНК, которые образуют жидкие каплеобразные безмембранные цитоплазматические компартменты в ответ на стресс. Основная функция SG заключается в том, чтобы способствовать выживанию клеток в условиях стресса, обеспечивая временный резервуар для хранения остановившихся в трансляции мРНК, RBP и рибосомных белков. Эукариотические клетки отключают некоторые клеточные трансляции в ответ на стрессы в окружающей среде (обычные стрессы в окружающей среде - гиперосмолярность, тепло и окислительные условия), чтобы сэкономить энергию и ответить на повреждение, вызванное стрессом.
Домен низкой сложности, содержащийся во многих RBP, связанных с SG, имеет тенденцию быть внутренне неупорядоченным и служит движущей силой для разделения липид-липидной фазы (LLPS), которое инициирует сборку SG.

В нормальных клетках после снятия стресса динамические SG быстро разбираются молекулярными шаперонами, UPS и VCP (UPS, убиквитин-протеасомная система; VCP, валозинсодержащий белок), тогда как аберрантные SG и твердые белковые агрегаты очищаются путем аутофагии. Дело в том, что при болезненных состояниях может происходить аберрантная сборка SG и/или фазовый переход из жидкости в твердую, вызывая образование твердых белковых агрегатов, которые считаются патогенными . Показано, что вызывающие заболевание мутации в генах, кодирующих SG-ассоциированные RBP, изменяют свойства белков, делая их менее растворимыми и склонными к агрегации. Кроме того, неправильное сворачивание белков увеличивается при клеточном стрессе и нарушении протеостаза. Неправильно свернутые белки, по-видимому, накапливаются в SG, что приводит к тому, что последние теряют жидкоподобную динамику и образуют агрегацию белков.

Белковый гомеостаз (протеостаз) относится к сбалансированному состоянию, в котором белки поддерживаются в правильной конформации, концентрации и внутриклеточном расположении, чтобы они могли выполнять свои клеточные функции для поддержания целостности и функциональности клетки. Для регуляции протеостаза в клетках развилась сложная система, которая контролирует весь жизненный цикл белков от синтеза до утилизации. Система регуляции протеостаза включает множество компонентов, в том числе механизм трансляции, молекулярные шапероны и ко-шапероны, убиквитин-протеасомную систему (UPS) и путь аутофагии.

Молекулярные шапероны представляют собой класс белков, которые способствуют сворачиванию и повторной укладке белков, а также сборке белковых комплексов. Белки теплового шока (Hsps), вероятно, являются наиболее широко изученными шаперонами, которые делятся на подсемейства в зависимости от их молекулярной массы, включая Hsp90, Hsp70, Hsp40 и малые Hsps. Hsps играют жизненно важную роль в рефолдинге, деградации и секвестрации неправильно свернутых белков либо АТФаз-зависимым, либо АТФаз-независимым образом, а также регулируют разборку и клиренс SG.

Убиквитинирование белков, по-видимому, является молекулярным сигналом, используемым как для деградации белков с неправильной укладкой, так и для оборота аберрантных SG. VCP извлекает РНК-связывающий белок G3BP1 из SG и запускает разборку SG; G3BP является ядром сети взаимодействия в SG. При тепловом шоке G3BP1 в SG подвергается массовому убиквитинированию; белок, ассоциированный с ER, FAF2 распознает убиквитинированный G3BP1 и доставляет его в VCP. «Извлечение» G3BP1 из SG с помощью VCP запускает диссоциацию других белков SG, что приводит к разборке SG.

У млекопитающих семейство белков G3BP состоит из трех гомологичных белков; G3BP1 (основной вариант), G3BP2a и его вариант сплайсинга G3BP2b; общая структура белка создает трехмерную платформу, которая связывает РНК. Отметим, что статус фосфорилирования G3BP1 может функционировать как переключатель роста клеток, где фосфорилированный G3BP1 путем связывания с 3'-UTR опосредует деградацию мРНК белков роста, и, таким образом, уменьшает клеточную пролиферацию. В целом статус фосфорилирования G3BP может влиять на судьбу мРНК, защищая их от деградации во время клеточного стресса, доставляя в SG. Кстати в пролиферирующих клетках G3BP1 гипофосфорилируется, теряя способность расщеплять мРНК.
3'-нетранслируемые области ( 3'-UTR ) матричных РНК (мРНК) регулируют процессы, основанные на мРНК, такие как локализация и стабильность мРНК, и трансляция. Именно к ним присоединяются RBP (см. выше), определяя посттрансляционные модификации. В целом 3'-UTR действуют как каркасы для регуляции локализации мембранных белков.

Хотя G3BP экспрессируются во всех нормальных клетках, некоторая специфическая экспрессия изоформ в тканях была идентифицирована для G3BP1 в легких и почках, для G3BP2a в мозге и для G3BP2b в тонкой кишке. G3BPs представляют собой главным образом цитоплазматические белки, но различие в распределении было зарегистрировано для различных изоформ: G3BP1 может локализоваться в ядрах в покоящихся клетках, наиболее вероятно из-за фосфорилирования в Ser149.

Раковые клетки требуют экспресии G3BPs, которые служат вспомогательными генами, способствующими их выживанию . Отметим, что G3BP являются важными составляющими вирусных фракций CHIKV и HCV, облегчая репликацию и сборку вирусов. Кстати, PTEN может модулировать уровни экспрессии нескольких белков, негативно регулируя уровни экспрессии белка G3BP1 и AKAP121.

Сверхэкспрессия G3BP1 опосредует EMT в клетках рака молочной железы через сигнальный путь Smad; нокдаун G3BP1 блокировал мезенхимный фенотип клеток. G3BP2 играет роль в инициации рака молочной железы путем стабилизации транскриптов мРНК онкогена SART3(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3), отвечающего за экспрессию плюрипотентных факторов транскрипции Oct-4 и Nanog. G3BP2 может служить позитивным регулятором инициации рака молочной железы, а также негативным регулятором метастазирования рака, так как G3BP2 нужен для приобретения свойств, инициирующих рак, а при метастатической колонизации раковые клетки должны потерять свой EMT-фенотип.
Кроме того, G3BP1 сверхэкспрессируется при гепатоцеллюлярной карциноме (HCC) и участвует в EMT из HCC, стимулируя экспрессию Slug, члена семейства транскрипционных факторов цинкового пальца SNAIL, которые индуцируют EMT. При раке поджелудочной железы межклеточное вещество уплотняется (жесткая матрица), TWIST1 отсоединяется от G3BP2 и движется к ядру, что приводит к индукции EMT.

[albert52]

Продолжим.

Сборка стрессовых гранул (SGs) и процессинговых Р-телец является хорошо известной клеточной стратегией для уменьшения повреждений, связанных со стрессом, и обеспечения выживания клеток. Остановка процесса трансляции из-за стресса создает обширный репозиторий компонентов SG, таких как факторы инициации трансляции, РНК- и не-РНК-связывающие белки и мРНК (см. выше). С снятием стресса и прекраще -нием ингибирования трансляции SG разбираются, и мРНК направляется к транслирующимся полисомам, а P-тела рекрутируют мРНК для возможной деградации.

Основной белковый компонент SG, состоящий из РНК-связывающих белков, также может иметь два специфических домена: прионоподобные богатые глицином домены низкой сложности (PLD) и внутренне неупорядоченные домены (IDD), которые могут образовывать белковые агрегаты. Перегруженные РНК белки (особенно белки с доменами IDD и PLD), диспергированные в цитоплазме или нуклеоплазме (растворимая фаза), сливаются в концентрированное состояние с образованием SG; при этом происходит разделение фаз жидкость-жидкость (конденсированная фаза).

В то время как многие острые стрессы способствуют конденсации SG через фосфорилирование eIF2α, было показано, что хронические стрессы преодолевают фосфорилирование eIF2α, что в конечном итоге снижает образование SG. При этом мРНК может идти тремя путями: оставаться в структуре SG и запасаться, возобновлять трансляцию или двигаться в сторону деградации.
С другой стороны, хронический стресс в некоторых случаях может способствовать увеличению фосфорилирования eIF2α, например, во время эпителиально-мезенхимального перехода и при нейродегенеративных заболеваниях; oжидается, что эти условия способствуют сборке SG. Фосфорилирование eIF2α, аналогично его роли в контексте острых стрессов, важно для индукции образования SG в условиях хронической нехватки питательных веществ; вероятно, это происходит посредством активации GCN2 (general control nonderepressible 2) вследствие накопления незагруженных транспортных РНК (тРНК), которые связываются с GCN2, что приводит к конформационным изменениям и активации киназы.

Отметим, что гомеостатическая интегрированная реакция на стресс (ISR) представляет собой эволюционно консервативный гомеостатический процесс, который позволяет клеткам млекопитающих ощущать, адаптироваться и соответствующим образом реагировать на широкий спектр внеклеточных и внутриклеточных сигналов стресса. Четыре различных эукариотических киназы фактора инициации 2 (eIF2), включая GCN2, РНК-зависимую протеинкиназу (PERK), протеинкиназу R (PKR) и гем-регулируемую киназу eIF2α (HRI), опосредуют ISR. GCN2 ощущает недостаток аминокислот, PERK активируется стрессом эндоплазматического ретикулума, PKR ощущает вирусную двухцепочечную РНК (dsRNA), а HRI ощущает депривацию гема. Кстати, большинство химиотерапевтических препаратов обычно стимулируют накопление SG, активируя эти фосфорилирующие киназы.

Белок-белковые и РНК-РНК-взаимодействия, которые удерживают вместе хронические SG, вероятно, аналогичны тем, которые были описаны для острого SG. Как и в случае острых стрессов, истощение G3BP1 и G3BP2 полностью нарушает конденсацию SG; при этом при хроническом алиментарном голодании истощение SG приводит к улучшению выживаемости. Дело в том, что внутри стрессовых гранул происходит частичная секвестрация рецепторов активированной С-киназы-1 (RACK1), что снижает активацию каспазы-3, то есть если образование SG блокируется во время стресса, выживаемость клеток значительно снижается. Однако SG, индуцированные патологическим хроническим стрессом (нейродегенерация, голодание по питательным веществам), лишены нескольких классических компонентов SG, которые вносят вклад в выживательные функции канонических SG (RACK1, малые рибосомальные белки) и, наоборот, имеют функцию про-апоптоза.

Образование SG, по-видимому, регулирует несколько канонических сигнальных путей (NF-κB, mTORC1, PKR, RIGI) в ответ на стресс. Так, SGs перехватывают и изолируют компоненты передачи сигналов, такие как RACK1 (передача сигналов p38/JNK), TRAF2 (передача сигналов NF-kB), Raptor (передача сигналов mTOR) и RhoA/ROCK1 (передача сигналов Wnt). Аутофагия частично отвечает за клиренс SG, предполагая, что благоприятные эффекты препаратов, индуцирующих аутофагию, могут быть частично связаны с усилением клиренса SG во время лечения.

SG и онкогенез

Рак можно обсуждать с трех разных точек зрения: формирование рака и онкогенез, выживание рака и метастазирование, инвазия и прогрессирование раковых клеток. Опухолевые клетки часто подвергаются хроническому стрессу, и помимо влияния на клеточную пролиферацию, проонкогенные гиперактивные сигнальные пути усиливают образование SG, что продлевает жизнь раковых клеток. Истощение SG приводит к улучшению выживаемости больных.

При раке от двадцати до тридцати процентов всех раковых заболеваний человека имеют изменения RAS (KRAS-HRAS-NRAS). KRAS часто встречается при аденокарциноме поджелудочной железы и колоректальном раке, NRAS — при меланоме, раке щитовидной железы и лейкемии. Мутантный белок RAS вооружает клетку против стрессов, связанных с опухолью; так, мутанты KRAS индуцируют образование SG путем повышающей регуляции 15d-PGJ2 (15-дезокси-дельта-простагландина J (2)) посредством нижестоящих эффекторных молекул, RALGDS и RAF, а также увеличения экспрессии циклооксигеназы-2 (COX-2).
15d-PGJ2 нацелен на цистин 264 в eIF4A, нарушая его взаимодействие с eIF4G, необходимое для процесса трансляции. Кстати, сорафениб, противораковый препарат, который попутно увеличивает продукцию SG по пути GCN2/eIF2a, сильно зависит от экспрессии COX-2, секвестированного в SG, и ингибирование COX-2 целекоксибом приводит к усилению ответа на лечение сорафенибом.

В пути pi3k/Akt mTORC1 ингибирует действие 4E-BP на eIF4E путем фосфорилирования и инактивации eIF4E-BP во время киназного каскада PI3K-mTOR, образуя комплекс eIF4F, который отвечает за идентификацию кэп-структуры на 5'-конце мРНК, инициируя, таким образом, трансляцию. Ингибируя mTORC1 при стрессе, eIF4E-BP остается активным и ингибирует образование комплекса eIF4F, останавливая процесс трансляции на начальной стадии. Этот процесс предрасполагает к формированию SG, оставляя PIC (преинициаторный комплекс) на мРНК, что действует как гнездо для SG.

Таким образом mTOR является одним из наиболее важных путей образования SG; ингибирование mTORC1 торкинибом может привести к нарушению образования SG или истощению eIF4G1 или eIF4E, что может нейтрализовать связанный с SG антиапоптотический путь p21. Также Grb7 (адаптерный белок 7, связанный с рецептором фактора роста) фосфорилирует условиях стресса тирозинкиназу Syk по остатку тирозина, вызывая образование SG, и сам рекрутируется в структуру SG. Когда стресс снимается, это рекрутирование способствует образованию аутофагосом и клиренсу SG в клетке, повышая способность клеток противостоять стрессовому стимулу.

В целом влияние SG на пролиферацию идет по двум путям — влияние на клеточный цикл и факторы, регулирующие пролиферацию, и влияние на транскрипты этих факторов. SG играют важную роль в поддержании клеток в развитии клеточного цикла и предотвращении вступления клеток в фазы клеточной гибели.
SP1 представляет собой транскрипционный фактор, играющий важную роль в регуляции SG-нуклеирующих белков, таких как HuR, TIA1/TIAR и G3BP1; истощение клеток по SP1 приводит к гибели клеток. HuR и CIRP совместно локализованы в SG, и CIRP играет ключевую роль в положительной регуляции HUR, а HuR повышает уровень циклина-Е1 в раковых клетках. Сверхэкспрессия циклина E1 увеличивает долю клеток в S-фазе, что приводит к усилению фосфорилирования Rb и клеточной пролиферации во многих моделях линий раковых клеток.

Отметим что регуляция сборки или разборки SG может быть ключевым методом контроля судьбы клеток или лечения заболеваний. Следовательно, это многообещающая область для разработки потенциальных терапевтических стратегий путем нацеливания на белки SG. Как пример рекрутирование мРНК в цитоплазме для слияния со зрелыми SG требует транспортировки по микротрубочкам моторными белками; таким образом, целостность микротрубочек важна для сборки SG. Микротрубочки представляют собой внутриклеточные структуры, собранные из гетеродимеров α- и β-тубулина и отвечающие за различного рода движения в клетках.
Деполимеризующие тубулин агенты могут вызвать исчезновение SG. Как обратимый ингибитор микротрубочек, нокодазол связывается с β-тубулином и нарушает кинетику сборки и разборки микротрубочек, тем самым предотвращая митоз и индуцируя апоптоз в опухолевых клетках. Нокодазол ингибирует образование SG, но не предотвращает фосфорилирование eIF2α, указывая на то, что он действует после фосфорилирования eIF2α.
Винбластин также вызывает деполимеризацию микротрубочек и, подобно нокодазолу, нарушает образование SG и разборку образовавшихся SG. Однако более высокая концентрация или длительное лечение винбластином сильно способствует репрессии трансляции и индуцирует микроскопические SG.