Очерк натуральной онкологии

[albert52]

Вернемся к сигнальным путям.

На большинство поступающих в клетку сигналов она реагирует не напрямую: между поступающим раздражителем и специфической реакцией клетки лежит целый внутриклеточный каскад сигнальных молекул, представляющих собой путь биохимических превращений. Задача таких биохимических путей — усилить или ослабить передаваемый клетке сигнал и перевести его в такую форму, чтобы позволить реализоваться ответным реакциям.
Комплексная взаимоорганизация всех задействованных в сигнальных путях белков формирует сеть внутриклеточной передачи сигналов, которая похожа на множество сотен сходящихся и вновь разветвляющихся, пересекающихся путей, переключающихся на различных белках, которые условно напоминают станции для пересадок в метро. B ней можно выделить несколько путей, которые в клетках большого количества опухолей дефектны и обнаруживают отклонения от нормы.

Mногие сигнальные пути довольно сложно различать как функционально, так и биохимически, и между многими из них зачастую существуют прямые активирующие и/или угнетающие связи. Примером тому может служить сеть p53/Rb, объединяющая важные сигнальные пути, которые регулируют процессы клеточного деления, апоптоза и репарации ДНК.
Рецепторы, с которых начинается путь МАРК, относятся к рецепторным тирозинкиназам (receptor tyrosine kinases, RTK). Многие гены рецепторных тирозинкиназ являются гомологами вирусных онкогенов. В зависимости от подтипа рецептора и задействованного адапторного белка активируются те или иные пути.
По структурным характеристикам внеклеточных доменов RTK можно разделить на несколько классов. К примеру, представители семейств PDGFR (рецептор тромбоцитарного фактора роста), FGFR (рецептор фактора роста фибробластов), VEGFR-1/-2 (рецептора фактора роста эндотелия сосудов) обладают соответственно пятью, тремя и семью Ig-подобными доменами. Однако несмотря на многообразие классов рецепторных тирозинкиназ, механизм их активации практически одинаков.

Согласно этой модели, в несвязанном состоянии между активными димерами и неактивными мономерами рецептора постоянно поддерживается равновесие. Присоединение лиганда ведёт к димеризации и смещает равновесие в сторону образования активной формы рецептора. Образование активных димеров может быть инициировано напрямую лигандами, связывающимися сразу с двумя мономерами, как, например, EGF (epidermalgrowth factor) способствует димеризации своего рецептора Egfr. Также связывание с лигандом может вызывать изменение конформации внеклеточного домена, что ведет к экспозиции сайтов связывания, как например, SCF (stem cell factor) вызывает димеризацию Kit-рецепторов.
Итогом процесса димеризации является сближение внутриклеточных доменов друг с другом, вследствие чего наступает преходящая активация внутренней тирозинкиназной активности каталитических доменов, что приводит к трансфосфорилированию специфических остатков тирозина цитоплазматического домена. С фосфорилированным рецептором могут связываться белки с SH2-доменами. Комплекс связанного с таким белком рецептора может опосредовать активацию, например, какого-либо фермента или изменение реакционной способности белка.
В отсутствие лигандов RTK представляют собой мономерные полипептидные цепочки (исключение — семейство рецепторов инсулина, которые состоят из 4 пептидных цепей, соединённых дисульфидными мостиками).

Активация RTK, предваряющая развитие событий внутри клетки, приводит к связыванию SH2-домена адапторного белка — GRB2 (Growth Factor Receptor bound 2) — на фосфорилированном остатке тирозина активированной RTK. Помимо SH2-домена, GRB2 содержит также два SH3-домена, имеющих сродство к взаимодействию с богатыми пролином участками белка, который гомологичен белку плодовой мушки Drosophila — SOS (son of sevenless) — и потому у млекопитающих данный белок также имеет название SOS. Этот белок является фактором обмена гуаниновых нуклеотидов и опосредованно (с помощью одного из Ras-белков: HRas, KRas, NRas) катализирует обмен ГДФ на ГТФ.
В ГТФ-связанной форме белки Ras способны активировать и другие протеины. Среди важнейших эффекторов Ras можно выделить фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), фактор обмена Ral (RalGEF) и фосфолипазу С (PLC).
Самым известным эффектором Ras является серин-/треонинкиназа B-Raf, которая ведет к запуску классического пути МАРК. Решающим моментом для активации В-Raf-киназы является не связывание на Ras-GTP, а перемещение на внутреннюю поверхность плазматической мембраны. Для завершения активирования белок должен быть также фосфорилирован, за что, вероятно, отвечает Src-киназа.

MAPK-каскад – ключевой в выживании и диссеминации опухолевых клеток, а также в их лекарственной устойчивости. Здесь сходятся сигналы от различных раздражителей, будь то внутренние “происшествия“ (метаболический стресс, повреждения ДНК и изменения концентраций белков) или связь с другими клетками, взаимодействия клетка-матрикс, сигналы от внешних факторов роста. Мутация генов, ответственных за регуляцию клеточной судьбы, целостность генома и выживание клеток, может привести к усилению амплификации белков и изменить микроокружение опухоли, тем самым вызвав чрезмерную активацию пути.
Понимание разной природы активации MAPK/ERK-пути для каждого вида опухоли – критически важный момент в создании монорежимов и комбинаций препаратов, так как разным опухолям присущи свои уникальные механизмы первичного и вторичного сигналинга и, как следствие, чувствительности к препаратам.

Эти мутации могут случиться как на вершине каскада, в генах мембранных рецепторов, например, EGFR, преобразователях сигналов (белков RAS), регуляторов (белков Sprouty), так и в киназах, расположенных ниже и принадлежащих собственно пути MAPK/ERK (BRAF). Некоторые из этих мутаций уже установлены и являются целью терапии. Действие препаратов основано на изменении и регуляции опухолевого сигналинга в этой сложной сети и зависящих от неё путях.

Всего существует 4 независимых каскада MAPK, состоящих из 4 сигнальных семейств: семейство MAPK/ERK, или классический путь, и 3 других семейства (Big MAP kinase-1 (BMK-1), c-Jun терминальной киназы и белка p38). Основная структура у этих семейств общая: 2 серин/треониновые киназы и 1 треонин/тирозиновая киназа двойной специфичности (она может фосфорилировать и треониновые, и тирозиновые остатки). В порядке генерацией сверху вниз, по направлению к ядру, эти киназы обозначены как киназа киназы MAPK (MAPKKK), киназа MAPK (MAPKK) и, собственно, MAPK. Традиционный путь MAPK/ERK состоит из 3 типов MAPKKK: киназы A-RAF, B-RAF и RAF-1 или C-RAF. На этом уровне в человеческих опухолях чаще всего мутирует ген BRAF. Уровнем ниже находятся MAPKK, их 2: MEK1 и MEK2. В самом низу каскада находятся конечные эффекторы пути MAPK – белки ERK1 и ERK2 (см. выше).

Фосфорилирование ERK приводит к активации нескольких субстратов, ответственных за стимуляцию размножения клеток. От местонахождения ERK зависит субстрат-цель и дальнейшие эффекты. Цитоплазменная ERK фосфорилирует белки цитоскелета, обеспечивая движения клетки, её метаболизм и адгезию и участвуя в регуляции других сигнальных путей. К цитоплазматическим субстратам относятся рибосомальные S6 киназы (RSK), которые регулируют киназу-3 гликогенсинтазы (участвует в метаболизме), и молекулы адгезии L1, блок неврального происхождения (участвует в клеточной адгезии). Сразу после активации MAPK/ERK ER киназа отделяется от цитоплазматических якорных белков и может переместиться в ядро (см. выше), где участвует в регуляции транскрипции.
Активная ERK в ядре фосфорилирует и активирует различные факторы транскрипции, например, карбамоилфосфатинтетазу II (CPS II), связанную с синтезом ДНК или p90RSK и поддерживающую ход клеточного цикла.

Кроме пространственной локализации конечные эффекты пути MAPK/ERK зависят ещё и от времени, длительности и интенсивности его сигнала. Восприятие и ответ клеток разнятся и зависят даже от небольших изменений в уровне активации MAPK/ERK. Специфические белки, например, супрессор киназы Ras-1, работают как главный каркас, основа для участвующих в активации каскада MAPK/ERK белков. Цитоплазматические белки, Sprouty и Spred, напрямую подавляют сигнальный путь, отсоединяя от ERK активирующие фосфатные группы, тем самым лишая ERK возможности фосфорилировать свои субстраты-мишени.

Сложность каскада MAPK – не случайность и не забавная шутка природы; она делает возможной периодическую внешнюю адаптацию, необходимую для активации и регуляции критических для выживания клетки событий. Активация MAPK/ERK и последующие взаимодействия – чётко регулируемые процессы, и в опухолевых клетках контроль над ними потерян.

[albert52]

Продолжим.

Стимуляция рецепторов факторов роста в клеточной мембране запускает 2 основных сигнальных пути, разных, но связанных между собой: сигнал фосфоинозитид-3-киназы(PI3K) активирует белок AKT, следовательно, его субстраты, и каскад MAPK/ERK. Оба этих пути управляют пролиферацией, выживанием и диссеминацией клеток. Каскад PI3K/AKT также поддерживает анаболизм, тогда как MAPK/ERK более активен в пролиферации и инвазии. Усиление сигналинга MAPK/ERK – результат гиперэкспрессии или неправильной активации рецепторов тирозинкиназ (RTK) или их прямых мишеней (PI3K, SRC и RAS). Нормальная работа MAPK/ERK также отвечает за подавление онкогенеза путём запуска механизмов старения и убиквитинизации. Старение включает в себя подавление пролиферации клеток с помощью терминального ареста клеточного цикла.

Генетические мутации могут разбалансировать активность киназ и гиперактивировать каскад MAPK во время запуска и развития онкогенеза. Онкогенных драйверных мутаций в MAPK/ERK установлено довольно много, и они различны для разных типов опухолей. Это могут быть и мутации 21 экзона в EGFR, и мутации KRAS, и классическая мутация V600EBRAF. В общем и целом мутации, затрагивающие MAPK/ERK, — события одиночные и независимые. Так, две трети карцином щитовидной железы несут активирующие мутации или в гене рецепторной тирозинкиназы RET, или KRAS, или BRAF1. И только в очень небольшом проценте опухолей были обнаружены мутации в двух различных генах сигнального пути.

Ингибиторы RAF могут запустить ненормальную пролиферацию клеток кожи и привести к возникновению кератоакантом или плоскоклеточного рака кожи приблизительно у 10-20% пациентов. Виной этому является парадоксальная активация каскада MAPK/ERK в нормальных кератиноцитах. Комбинация ингибиторов BRAF и MEK при метастатической меланоме повысила безопасность лечения, сбалансировав активацию нормального MAPK/ERK, и значительно снизила частоту парадоксальных онкогенных изменений кожи. В целом использовать генные мишени в своих целях следует с учётом уникальных черт, присущих человеческим опухолям.

Белки Ras закреплены на клеточной мембране с внутренней стороны посредством жирной кислоты, ковалентно связанной с карбокситерминальным концом белка, и это семейство белков можно сравнить с молекулярным переключателем МАРК. Обмен ГДФ на ГТФ и сопряжённый с этим переход неактивной формы Ras в активную катализируется SOS (SOS1, SOS2) — ферментом, относящимся к группе факторов обмена GEF (Guanine Exchange Factors).
Активная форма Ras может проявлять собственную невысокую ГТФ-азную активность и гидролизовать связанный ГТФ до ГДФ, тем самым самоинактивируясь. Этот процесс довольно длителен, хотя и облегчает обмен на GTP, который присутствует в гораздо более высоких концентрациях в цитозоле, но он многократно ускоряется ГТФ-аза-активирующими белками (GAP), например, p120GAP (p120 GTPase activating Protein) и нейрофибромином (NF1GAP). Мутации в генах онкопротеинов Ras ведут к предотвращению реакции гидролиза, вследствие чего сигнальный путь длительное время остаётся активным.

Наряду с Ras существуют и другие ГТФ-связывающие белки, которые с помощью подобных биохимических механизмов активируются или инактивируются и имеют различные задачи. Малые ГТФазы имеют примерно половину размера α-субъединицы гетеротримерных G-белков и среди них хотелось бы упомянуть семейство Rho, представители которого играют ключевую регуляторную роль в сигнальной передаче от цитокиновых рецепторов, а также в организации актинового цитоскелета клетки и микротрубочек. Rho GTPases составляют подсемейство малых GTPases, которое также включает подсемейства Ras, Ran, Rab и Sar1/Arf. Rho GTPases контролируют множество клеточных функций посредством регуляции сократительной способности актина и периферических актиновых структур, включая морфологию клеток, локомоцию и полярность.
Активные Rho ГТФ-азы располагаются на клеточной мембране, где, связывая специфические эффекторные белки, они обеспечивают последующую трансдукцию сигнала, вызывая перестройку цитоскелета. Находясь в неактивной конформации, Rho GTPases связываются с ингибиторами диссоциации гуаниновых нуклеотидов (GDI), что способствует их стабилизации и предотвращает их активацию.

Семейство малых G-белков Rho (~21 кДа) включает 20 членов, классифицированных как Rac (Rac1, Rac2, Rac3 и RhoG), Rho (RhoA, RhoB и RhoC) и Cdc42 (Cdc42, TC10, Chip, TCL, и Wrch-1) и другие менее изученные ГТФазы, включающие RhoD, RhoE и RhoH. Rho благоприятствует ранним стадиям онкогенеза, однако RhoB может ограничивать развитие высокоагрессивных опухолей; потеря RhoA скорее ускоряет образование аденом легких.

Rac участвуют в образовании активных форм кислорода (АФК) посредством активации никотинамидадениндинуклеотидфосфатных (НАДФН) оксидаз NOX1 и NOX2. Rho регулирует образование стрессовых волокон и сокращение клеток, тогда как Rac и Cdc42 регулируют образование ламеллоподий и филоподий соответственно, и стимулируют протрузивную деятельность (динамические события в передней части движущихся клеток, обеспечивающие их продвижение).
Убиквитинирование лигазами FBXL19 и HACE1 E3 влияет на уровни экспрессии Rac. В соответствии с ролью Rac в контроле комплексов НАДФН-оксидазы, дефицит супрессора опухоли HACE1 увеличивает выработку активных форм кислорода (АФК), что, в свою очередь, приводит к зависимости от Gln, основного источника питательных веществ для опухолевых клеток. Более того, подавление HACE1 взаимодействует со сверхэкспрессией ErbB2/HER2 в клетках молочной железы, вызывая гиперактивацию Rac1, миграцию, злокачественную трансформацию и онкогенез in vivo.

Семейство Pak расположенно ниже как Rac, так и Cdc42 и являются критическими эффекторами, которые связывают семейство Rho GTPases (Rho GTPases) с реорганизацией цитоскелета и ядерной передачей сигналов. p21-активируемые киназы (PAK) представляют собой Ser/Thr киназы, которые на основании их структурных и функциональных особенностей подразделяются на две группы: группу I (PAK1–3) и группу II (PAK4–6). PAK группы I имеют аутоингибирующий домен (также называемый ингибирующим доменом-переключателем) и киназный домен (каталитический домен, CD) и активируются за счет связывания активных (то есть связанных с GTP) форм Rho GTPases, таких как как Cdc42 и Rac1. PAK группы II не имеют автоингибирующих доменов и не активируются активными Rho GTPases.

Тот факт, что на сегодняшний день идентифицировано около 80-ти типов GEF и 70-ти — GAP, что количественно превосходит Rho ГТФ-азы, коих имеется около 20-ти, может говорить о необходимости строгого контроля регуляции локальной активности Rho, чтобы предотвратить ошибочную передачу исходного сигнала. В опухолевых клетках активность Rho ГТФ-аз ненормально высока, что может быть обусловлено изменённой генной экспрессией или нарушенной функцией регуляторов, в меньшей степени — активирующими мутациями в самих Rho ГТФ-азах.

Множественность клеточных исходов, регулируемых более чем 70 идентифицированными Rho GEF, диктуется их дифференциальным паттерном экспрессии и селективностью в отношении белков Rho, а также сложными механизмами, регулирующими их активацию. Среди многих GEF семейства Rho, регулирующих активность Rac и участвующих в прогрессировании рака, члены семейства Ect2, Tiam1, P-Rex и Vav являются наиболее заметными, связанными с онкогенезом и метастазированием. Например, избыточная экспрессия Vav3 при раке яичников связана с плохим прогнозом и придает резистентность к установленным терапевтическим режимам.
P-Rex1 демонстрирует значительную базальную ассоциацию с плазматической мембраной; сходным образом значительное количество PI 3-kinase-γ связано с мембраной даже в отсутствие стимуляции. Эта базовая ассоциация PI 3-киназы- γ и P-Rex1 с плазматической мембраной может быть необходима для чрезвычайно быстрой активации Rac. Кстати, эти молекулы могут быть аллостерически активированы с помощью скаффолдов.
Повышенный ядерный Rac1 в опухолевых клетках может быть результатом дисбаланса в ядерно-цитоплазматическом перемещении этого белка, вызывающего снижение активного цитоплазматического Rac1 и сопутствующее повышение активного RhoA, что способствует сократимости актомиозина, необходимой для клеточной инвазии.

Среди RhoGAP-белков особенно выделяют семейство DLC-белков (deleted in liver cancer), поскольку именно их инактивация является наиболее частым изменением Rho-регуляторов при развитии опухолевых процессов. При некоторых типах рака утрата DLC1 встречается настолько же часто, как и выпадение опухолевого супрессора р53; так, белок DLC1 отсутствует в клетках различных опухолевых образований (молочной железы, кишечника, лёгких, простаты) по причине инактивации соответствующего ему гена. «Выключение» DLC1 вызывает усиленное образование т.н. активных стрессовых волокон и сопряжено также с повышенной миграционной активностью раковых клеток.
Вообще в геноме человека закодированы три изоформы DLC, имеющие цифровое обозначение от 1 до 3. DLC1-3 обладают схожей структурной организацией и регулируют активность малых ГТФ-аз RhoА и Cdc42. DLC3, например, контролирует передачу сигналов от рецептора фактора роста EGFR и выполняет функцию стабилизации в постоянных клеточных контактах. Утрата функции DLC3 в опухолевых клетках может, с одной стороны, привести к yсилению сигналов в клетку от рецепторов ростовых факторов и, с другой стороны, стать причиной ослабления контактов между структурами эпителиальных тканей, что способствует как возникновению опухоли, так и её метастазированию.

[albert52]

Вставка.

Цитоскелет в норме и при онкологии

Одна животная клетка обладает способностью адаптировать свою форму в ответ на ограничения окружающей среды или химические сигналы, перемещаться по тканям (искусственным и in vivo, включая узкие пространства) и делиться. Все эти процессы, по крайней мере частично, управляются сборкой - разборкой цитоскелетных белков. Для формирования множества различных цитоскелетных структур, как это наблюдается в клетках животных, цитоскелетная сеть нуждается не только в различных компонентах с различными свойствами и функциями, но также в жесткой и точной регуляции (сборке-разборке) ее компонентов, т.е. соответствующая локальная регуляция факторов (дез-)сборки и взаимодействия между сетями актина, микротрубочек и промежуточных филаментов.

В клетках актин встречается в двух различных состояниях: мономерном G-актине и нитевидном F-актине. Модуляция актинового цитоскелета регулируется балансом глобулярного G- и полимерного F-актина и актин-ассоциированными белками. Актиновый цитоскелет образует сеть, состоящую из поляризованных филаментов, которые в основном связаны с генерацией силы, необходимой для движения, фокальной адгезии и изменения формы.
Образующиеся актиновые филаменты имеют правозакрученную спиральную структуру. G-актин поляризован, поэтому F-актин также поляризован, причем менее динамичная сторона называется (-)-концом, а более динамичная (+)-конец, который имеет скорость полимеризации в десять раз выше, чем (-)- конец. Поскольку актин представляет собой АТФазу, (+)- и (-)-концы также можно различить по их АТФ/АДФ-статусу; (+)-конец содержит большее количество актина, связанного с АТФ, в то время как (-)-конец содержит больше актина, связанного с АДФ.

Профилин (Profilin) является актин-связывающим белком, который регулирует гомеостаз актина путем ингибирования спонтанного образования ди- и тримеров актина, а также катализирует переход от АДФ- к АТФ-актину. Связанный с Profilin G-actin может быть использован для построения актиновых филаментов, если присутствуют факторы нуклеации (запуска), такие как комплекс Arp2/3 (actin-related-proteins 2/3) или формины. Нуклеация – соединение трех G-актинов с инициацией полимеризации. Интересно, что если присутствуют формины и профилин, удлинение свободного актина может увеличиваться в 9 раз; профилин также ингибирует полимеризацию на (-)-конце актина.

Некоторые члены семейства форминов также перемещаются с конца филамента в середину, дополнительно функционируя в качестве сшивающих агентов для стабилизации генерируемой структуры. Поскольку формины не обязательно образуют пучки филаментов, другие белки, такие как сшивающие линкеры или Ena/VASP, также участвуют в формин-зависимом образовании пучков. Ena/VASP представляет собой семейство белков, связанных с функцией антикэппинга (кэппинг - это колпачок на конце актиновой нити) и удлинением, но не обладающих активностью нуклеации сами по себе.

Кроме квазилинейных актиновых филаментов существуют дендритные актиновые сети, образованные комплексом Arp2/3. Эти сети обычно формируются на клеточном фронте в течение короткого промежутка времени, поэтому их регуляция имеет большое значение. Генерация дендритной актиновой сети начинается с так называемого праймера - существующего актинового филамента, на котором Arp2/3 соединяется с его стороной; Arp2/3 среди прочего активируется членами семейства WASP. Для образования плотной дендритной сети необходимы не только факторы нуклеации, но и кэпирующие белки, ограничивающие удлинение актиновых (+)-концов.

Если присутствуют кэпирующие белки, комплекс Arp2/3 может генерировать множественные сети, происходящие из разных актиновых филаментов, которые способны сливаться и генерировать силы вблизи клеточной мембраны. Количество узлов важно для механических свойств генерируемой сети, причем дендритная сеть ведет себя вязкоупругой, то есть она в основном эластична в малых временных масштабах (<1 мин) и вязкая в более длительных масштабах времени (>10 мин).

Другим важным классом молекул является семейство миозинов. Миозин отвечает за сократимость антипараллельных актиновых структур, используя гидролиз АТФ в качестве источника энергии. Эти сократительные структуры в основном отвечают за ретракцию (сжатие) задней части клетки для продуктивного движения, а также за передачу сил окружающему внеклеточному матриксу. Миозин II может быть активирован посредством фосфорилирования регуляторной легкой цепи (RLC) или активации киназ легкой цепи миозина (MLCK). RLC активируется с помощью Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) или цитронкиназ (обе активируются RhoA) и MLCK (Myosin light chain kinase) с помощью Ca 2+ .

После фосфорилирования RLC миозин способен генерировать сократительные силы. Другой тип регуляции работает через фосфорилирование тяжелой цепи миозина с использованием киназ тяжелой цепи миозина (MHCK), казеинкиназы II (CKII) или протеинкиназы C (PKC), ингибируя сборку мини-филаментов или диссоциируя существующие мини-филаменты. Переключение между этими двумя состояниями активации влияет на сократимость соответствующей актомиозиновой сети.

Существуют также актиновые пучки и сети, связанные между собой кросс-линкерами. Здесь сшивающие агенты представляют собой молекулы, которые соединяют отдельные актиновые филаменты и являются либо пассивными (например, скруин, фацин, α-актинин, филамин или фимбрин), либо активными (миозин). Сшитые актиновые пучки и сети в значительной степени контролируют форму, механическую целостность и способность клетки к сокращению. Как правило, сшивающие агенты не влияют на сборку актина (за исключением Arp2/3).
Если актиновые филаменты связаны сшивателями, филаменты внутри пучка могут быть ориентированы либо параллельно, либо антипараллельно, что означает, что (+)-концы соседних филаментов указывают в том же или противоположном направлении. Механические свойства (анти-)параллельных пучков зависят от типа и плотности сшивающих агентов и, таким образом, от компактности пучка и от того, допускает ли пучок скольжение одиночных нитей. Параллельные актиновые пучки обнаруживаются среди др. в филоподиях, в то время как антипараллельные пучки в основном обнаруживаются в стрессовых волокнах.

Поскольку большинство актиновых структур стабильны во времени, клеткам необходим механизм, вызывающий разборку актина, чтобы адаптироваться к сигналам окружающей среды. Один из таких механизмов управляется семейством актин-связывающих белков ADF/cofilin, способных разбирать и фрагментировать актиновые филаменты, но не способных изменять скорость полимеризации. Предпочтение более старого актина, связанного с АДФ, подразумевает, что разборка с АДФ/кофилином в основном затрагивает неактивные компартменты актиновой сети.

Глядя на подвижную клетку, чистое движение является результатом множества, в основном актин-зависимых, процессов, а именно: образование выпячиваний в направлении движения, последующая адгезия к субстрату и потеря адгезии на задней части клетки с последующим сокращением. Эти процессы регулируются субклеточными структурами, такими как филоподии и ламеллиподии, регулирующие движение клеток, в то время как стрессовые волокна обеспечивают механическую стабильность и способность к сокращению. Другими типами выпячиваний являются так называемые пузырьки, которые способны регулировать движение клеток независимо от филоподий и ламеллиподий.

Ламеллиподия представляет собой плоскую структуру, в основном связанную с движением клеток, образующуюся в результате полимеризации актина на клеточном фронте, в то время как она деполимеризуется в своей задней части под действием АДФ/кофилина, восполняющего пул G-актина.Наиболее важным фактором образования ламеллиподия является внутренне неактивный комплекс Arp2/3, который активируется комплексом Scar/WAVE в процессе активации небольшой Rho GTPase Rac1 (см. выше). Этому дополнительно способствует присутствие членов семейства Ena/VASP, аккумулирующихся на кончиках ламеллиподий, способствуя дальнейшему удлинению актина и предотвращая кэпирование.

Несмотря на активный комплекс Arp2/3, кэпирующий белок также необходим для ограничения удлинения одиночных филаментов, чтобы они оставались продуктивными и не образовывали пучки с другими некэпированными филаментами или изгибались под нагрузкой.
Для создания стабильной дендритной сети ее сшивают такими белками, как кортактин. Поскольку описанная регуляция с помощью Rac1 приводит к постоянному росту ламеллиподия, она должна быть ограничена петлей отрицательной обратной связи. Одним из возможных механизмов является белок arpin, который ингибирует активность Arp2/3 в ламеллиподии. Было предположено, что arpin рекрутируется с помощью Rac1, т.о., кажется возможным, что активация Rac1 инициирует рост ламеллиподия за счет быстрого рекрутирования Arp2/3 и последующей полимеризации актина, а позже ингибирует его рост за счет рекрутирования arpin.

Помимо динамики актина на ламеллиподию также влияет клеточная мембрана и ее поверхностное натяжение. Более высокое поверхностное натяжение мембран приводит к более ориентированной полимеризации актиновых филаментов, в то время как более низкое натяжение приводит к большему количеству выпячиваний.

Дополнительными структурами, связанными с подвижностью клеток, являются филоподии, которые образуют структуру, состоящую из параллельных пучков актина, причем их (+) -концы направлены в направлении клеточной мембраны. Эта ориентация устанавливается с помощью форминов (например, FMNL2) и Ena/VASP, которые способны поддерживать длительную полимеризацию актина. Затем стабилизация и связывание сшивающими агентами, такими как fascin, генерирует "зрелые" филоподии. Помимо своей роли в клеточном движении, филоподии инициируют межклеточные контакты, передают межклеточные сигналы и реагируют на механические свойства своего окружения.

[albert52]

Продолжим.

Стрессовые волокна представляют собой собранные пучки из 10-30 актиновых филаментов, сшитых α-актинином биполярным образом и связанных фокальными адгезиями; очаговые адгезии представляют собой участки связывания, которые соединяют клетку с субстратом. Сократительные стрессовые волокна являются одним из основных факторов сократительной способности клеток многих животных клеток. В неподвижных клетках стрессовые волокна обычно толстые и относительно стабильные, в то время как подвижные клетки обычно содержат меньше менее выраженных волокон с более высокой динамикой. Актин и миозин являются двумя основными составляющими сократительных стрессовых волокон, в то время как несократительные не содержат миозин.
Стрессовые волокна могут содержать дополнительные сшивающие агенты, такие как фасцин, филамин и паладин; другие молекулы, например, кальпонин, тропомиозин, семейство кальдесмонов и др., обнаружены в стрессовых волокнах, и предполагается, что все они являются частью регуляции цитоскелета и/или стрессовых волокон.

Вообще говоря, образование стрессовых волокон напрямую связано с активацией формина mDia1 и малой Rho GTPase RhoA, активирующей ROCK. Формин способствует длительной полимеризации актина параллельных филаментов, важных для стрессовых волокон, и, кроме того, ROCK активирует миозин, способствуя образованию стрессовых волокон. Тем не менее, как ROCK, так и форминовые механизмы необходимы для образования сократительных стрессовых волокон.
Rho GTPases Cdc42 и Rac1, действуют более опосредованно через индукцию ламеллоподиального роста через Arp2/3 (Rac1) и образование филоподий через формин mDia2 (Cdc42), которые могут функционировать как зародыш как для поперечных, так и для вентральных стрессовых волокон. Последние ориентированы параллельно направлению движения клетки и соединяют места спаек клетки, а поперечные стрессовые волокна могут вносить вклад в общую сократимость благодаря их соединению с дорсальными стрессовыми волокнами. Есть еще дорсальные стрессовые волокна, обычно несократимые, которые генерируются посредством полимеризации актина при появлении фокальных спаек и стабилизируются во время фаз ретракции ламеллиподия посредством сцепления с возникающими поперечными стрессовыми волокнами.

Третьим типом сократительных стрессовых волокон является так называемая перинуклеарная шапочка, состоящая из стрессовых волокон, расположенных над ядром и регулирующих форму ядра. Кроме того, предполагается, что они служат механической связью между ядром и остальной частью клетки. Общим для всех этих типов сократительных стрессовых волокон является то, что они сильно зависят от присутствия и активности миозина и, таким образом, от напряжения. Следовательно, ингибирование миозина приводит к разборке этих стрессовых волокон.

Выделяют еще актиновую кору, которая образует сократительную структуру актина на границе с плазматической мембраной; механические свойства коры определяют, как клетка деформируется в ответ на внешние силы. Более низкое напряжение коры связано с повышенной протрузивной активностью клетки, таким образом косвенно регулируя подвижность клеток. Кора представляет собой слой толщиной в несколько сотен нанометров, состоящий из смеси пучков филаментов; сеть коры в основном изотропна, ориентирована параллельно плазматической мембране, но некоторые филаменты также ориентированы перпендикулярно мембране. Эта кора содержит много малых ГТФ-аз и их мишеней (см. выше).
Интересно, что причиной так называемых пузырей могут быть локальные падения напряжения коры или адгезии коры к мембране, а также локальные разрывы коры - особое, изначально свободное от актина выпячивание мембраны. Максимальный размер пузыря определяется начальной скоростью роста и временем повторной полимеризации коры, оба зависят от натяжения коры. После полного созревания кора реконструируется, и если пузырь не стабилизируется за счет спаек, он втягивается восстановленной корой посредством миозин-индуцированного сокращения. В некоторых подвижных клетках пузыри стабилизируются и используются как альтернативный или дополнительный способ миграции.

Для полноты следует упомянуть, что актин присутствует не только в цитоплазме эукариотических клеток, но и в ядре. Как и в цитоплазме, ядерный актин существует в мономерной и полимерной форме. Показано, что ядерный G-актин связывается со всеми тремя РНК-полимеразами, участвуя в инициации транскрипции и элонгации. На выходе из митоза хроматин реорганизуется в зависимости от временного образования полимерного актина, по-видимому, кофилин-зависимым образом.

Микротрубочки состоят из гетеродимеров α- и β-тубулина, образующих полые филаменты, обычно состоящие из 13 протофиламентов; они демонстрируют поведение, называемое динамической нестабильностью, характеризующееся внезапным переключением с роста на остановку роста и/или быструю деполимеризацию (называемую катастрофой), за которой следует новый цикл роста.
Белки, взаимодействующие с микротрубочками, представляют собой либо белки, связывающие (+)-концы микротрубочек (+TIP), либо структурные белки, ассоциированные с микротрубочками (MAP), взаимодействующие с микротрубочками по их длине. Эти классы белков могут оказывать стабилизирующее или дестабилизирующее действие, изменяя динамику полимеризации или разрывая микротрубочки. Важными белками, принадлежащими к семейству +TIPs, являются CLASPs (белок, ассоциированный с цитоплазматическим линкером) и APC, которые подавляют катастрофические события микротрубочек и способствуют восстановлению после катастрофы.

Другими важными семействами +TIPs являются спектроплакины, связывающие как микротрубочки, так и актин, и EBs (концевые связывающие белки). Предполагается, что EBs являются основным регулятором рекрутирования +TIP (например, CLASP, APC, MACF1 (микротрубочковый-актиновый фактор перекрестного связывания) и комплексной сборки, обычно способствуя персистентному росту микротрубочек. Помимо этих молекул, которые в основном (де-)стабилизируют микротрубочки, существует группа белков, которые разрывают микротрубочки, такие как спастин или катанин или влияют на деполимеризацию и полимеризацию, например, статмин (способствует деполимеризации) или XMPA215 (увеличивает скорость полимеризации).

Важным компонентом MAP являются моторные белки kinesin и dynein, оба служат переносчиками грузов, используя сеть микротрубочек. В целом кинезиновые моторные белки транспортируют груз к (+)-концу, в то время как динеин перемещается к (-)-концу микротрубочек, транспортируя различные типы грузов, включая мембранные компоненты, сигнальные молекулы, такие как малые GTPases Rac и Cdc42, а также промежуточные филаменты и их предшественники, мРНК, кодирующие β-актин, и субъединицы комплекса Arp2/3.
В нейронах кинезин-5 и кинезин-12 необходимы для роста аксонов из-за их способности к поперечному связыванию и сопутствующей концентрации на расширении массивов микротрубочек. Микротрубочки также играют ключевую роль во время разделения хромосом во время клеточного деления. Считается, что деполимеризация микротрубочек создает необходимые силы для разделения сестринских хроматид.

Белки, образующие промежуточные филаменты, представляют собой большой класс белков, кодируемых не менее чем 70 генами, организующими филаменты диаметром 10 нм. Для их зарождения и полимеризации кофакторы не нужны (эволюционно они наиболее древние). Промежуточные филаменты сгруппированы в 5 классов в соответствии с их структурой и гомологией последовательностей. Таким образом, первые четыре класса представляют собой цитоплазматические промежуточные филаменты, а тип V – ядерные филаменты, так называемые ламины (ламин А/С, В1, В2). Еще два промежуточных филамента, называемых филенсин и факинин, нельзя отнести к упомянутым пяти типам; они экспрессируются в эпителии хрусталика, образуя гетерополимеры.
Вблизи коры промежуточные филаменты взаимодействуют с очагами адгезии, десмосомами и полудесмосомами, поддерживая адгезию клеток и тканей. Наоборот, десмосомы и фокальные адгезии функционируют как центры образования de novo промежуточных филаментов. Благодаря закреплению на ядерной и плазматической мембранах промежуточные филаменты образуют каркас для митохондрий, аппарата Гольджи и других органелл и организуют их расположение. Из-за своей сетевой структуры и способности закреплять органеллы промежуточные филаменты часто рассматриваются как механические буферы.

Еще одним фактором, влияющим на организацию промежуточных филаментов, является семейство белков plakin, соединяющих микротрубочки и актин с промежуточными филаментами; некоторые промежуточные филаменты также могут ориентироваться вдоль актинового цитоскелета или микротрубочек. Промежуточные филаменты также связывают ядро ​​с цитоплазматическим цитоскелетом через комплекс LINC (linker of nucleoskeleton and Cytoskeleton), присутствующий на ядерной мембране, связывающийся с плектином и тем самым с промежуточными филаментами. Следовательно, нарушение функции LINC приводит к нарушению передачи силы из-за ослабления связи ядра и цитоскелета.

Другими типами промежуточных филаментов являются ядерные ламины. В то время как ядерные ламины вблизи ядерной периферии образуют сеть филаментов, присутствие кажущихся менее плотными структур ламинов в нуклеоплазме согласуется с наблюдением их более высокой подвижности. Интересно, что нокдаун ламина А ингибирует экспрессию генов, связанных с цитоскелетом актомиозина, как показано в мезенхимальных стволовых клетках.

[albert52]

Продолжим.

Одним из очень важных свойств клетки является ее способность двигаться, особенно в контексте преследования иммунными клетками патогенов, закрытия ран или метастазирования опухолевых клеток. Чтобы клетки могли эффективно двигаться, необходимо несколько универсальных шагов, а именно: необходимо сформировать выпячивания, которые прикрепляются к своему окружению, и, следовательно, необходимо сокращение и втягивание задней части. Характерной чертой клеточной миграции является точная координация этих событий в пространстве и времени. Если, например, созревание спаек на клеточном фронте не завершено, усиление сокращения приводит к разрыву новообразованных спаек, отказу от продуктивного движения.
Для достижения продуктивного движения и правильного выбора времени этапов миграции клетки разработали два различных способа миграции: амебоидный и мезенхимальный. Миграция амебоидных клеток характерна для округлых клеток с низкой адгезией и высокой Rho-управляемой сократимостью, тогда как мезенхимальные мигрирующие клетки демонстрируют сильную адгезию и Rac1-индуцированные выпячивания в соответствии с взаимной негативной регуляцией Rac1 и RhoA .

Актиновые филаменты вносят основной вклад в миграцию клеток с точки зрения генерации силы спереди клетки и сокращения сзади. В то время как мезенхимальное движение в основном достигается за счет расширения ламеллиподия или филоподии, амебоидная миграция происходит за счет расширения пузырьков. Непрерывная (де-)полимеризация актина создает эффект бегущей дорожки и, следовательно, вызывает ретроградный поток актина. Поток в направлении, противоположном ретроградному потоку, генерируется сокращением стрессовых волокон, транспортиющим актин к клеточному фронту. Чтобы удерживать ламеллиподию на месте и предотвращать ретракцию посредством, например, натяжения актиновой коры, необходимо образование новых контактов клетка-ВКМ.

Вообще говоря, во время растяжения ламеллиподия формируются зарождающиеся спайки, которые созревают в фокальные спайки или распадаются. В то время как Rac1 контролирует образование зарождающихся спаек, созревание контролируется RhoA и индуцированной миозином II сократимостью, что делает их точками крепления стрессовых волокон. Для продуктивного движения необходимо пространственно ограничить полимерицию актина одной зоной. Таким образом, предполагается, что Rac активен только локально. Дальнейший возможный механизм включает путь Rho/ROCK и сократимость актомиозина для ингибирования образования ламеллиподия во множестве клеточных областей.

Блеббинг- это способ миграции у неадгезивных или слабо адгезивных клеток, движущихся в трехмерном матриксе или в замкнутых средах, в частности раковых клеток. Пузыри, возникающие в основном за счет сокращения актиновой коры, изначально представляют собой свободные от актина структуры, которые возникают под действием гидростатического давления, вызывающего отделение актиновой коры от мембраны, таким образом расширяя клеточную мембрану( кстати, она обычно может растягиваться только примерно на 4% перед разрывом ). Если пузырьки расширяются и образуют выпячивания по бокам клетки в промежутки субстрата, тогда сократимость восстановленной коры может генерировать результирующую силу, тянущую тело клетки.
Расширение пузырей происходит быстрее, чем рост ламеллоподов, может происходить в произвольных направлениях, и, следовательно, они могут иметь большое значение в сложных трехмерных (in vivo) средах, где ламеллоподиальное расширение серьезно затруднено.

Для эффективной миграции задняя часть клетки также должна сокращаться. Чтобы активно сокращаться, актиновые структуры используют миозин для скольжения антипараллельных актиновых волокон вдоль друг друга, создавая сократительные силы, если филаменты закреплены, например, в фокальных спайках; лучше всего для этого подходят стрессовые волокна (см. выше). При этом дорсальные стрессовые волокна помогают созреванию фокальных спаек за счет натяжения на переднем крае; а идее ретракции сзади через стрессовые волокна способствует градиент адгезии с более низкой адгезивностью сзади.

В целом актин или, если быть более точным, ламеллиподии, филоподии и пузырьки являются основными причинами генерации силы для подвижности клеток, а сократительные структуры, такие как стрессовые волокна, являются драйверами заднего сокращения.

В отличие от актина, микротрубочки в основном не связаны с генерацией силы во время миграции, а скорее с поляризацией клеток и фокальными адгезиями. Роль микротрубочек можно, в принципе, разделить на три категории, а именно: участие в подвижности клеток посредством их собственной механики, посредством передачи сигнала и в качестве транспортной структуры. Микротрубочки также способны выдерживать высокое внешнее давление и, таким образом, помогают поддерживать форму клеток. Примечательно, что стабилизация микротрубочек способствует не только более стойкому росту микротрубочек, но и более стабильному снабжению материалом, необходимым для миграции, поскольку эти микротрубочки дольше сохраняются вблизи переднего края. При этом некоторые кинезиновые моторы для микротрубочек стабилизированы ацетилированием и детирозинированием, а стрессовые волокна, по-видимому, функционируют как направляющая структура для микротрубочек, опосредованная спектроплакином MACF1 (Microtubule Actin Crosslinking Factor 1).

Также возможна петля положительной обратной связи, когда стимуляция интегрином может вызвать скорую доставку груза в место адгезии. Еще одной возможностью является взаимодействие FAK или paxilin с APC, которые кластеризуются на кончиках микротрубочек. А разрушению фокальных адгезий (спаек) сзади способствуют клатрин-опосредованный эндоцитоз интегринов, NBR1-опосредованная аутофагия или везикулы, несущие матриксные металлопротеиназы, разрывающие связи интегрин-ECM.

В целом, чтобы добиться сильной адгезии к соседям и выдержать стресс и напряжение, эпителиальные клетки вырабатывают множество различных специализированных адгезивных структур; их разрушение происходит во время прогрессирования опухоли. Кадгерин-опосредованная адгезия требует активности цитозольных белков подсемейства Rho - Rho, Rac и CDC42 (Cell Division Cycle-42), принадлежащих суперсемейству Ras малых GTPases, поэтому дерегуляция Rho GTPases была обнаружена во многих опухолях человека.

Если суммировать все вышесказанное, при стимуляции различными сигналами, включая интегрин, рецепторы GPCR (G-protein-coupled receptors) и тирозинкиназы, активируются RHO GEF. Впоследствии активированные RHOA, RAC1 и CDC42 связываются и специфически активируют свои нижележащие эффекторы, включая протеинкиназы (например, PKN, ROCK и Citron) и каркасные белки (например, WASP, IRSp53 и mDia). Эти белки-мишени активируют различные сигнальные пути, играющие несколько ролей в клеточной подвижности, клеточном цикле, фагоцитозе и транспортировке через мембраны.
Так, в ответ на различные раздражители мигрирующие клетки вступают в цикл клеточной подвижности. На переднем крае Rас 1 индуцирует образование богатых актином ламеллиподий. CDC42 определяет формирование филоподий и направление движения. Новые протрузии прикрепляются к ВКМ посредством формирования фокальных комплексов, которые контролируются главным образом Rас 1 и RHOA. Затем тело клетки сокращается в зависимости от образования стрессовых волокон и сокращения актин-миозиновых волокон, которое опосредовано RHOA и ROCKs. Наконец, задние спайки растворяются, залняя часть клетки втягивается, и клетка движется вперед.

Rac1 является небольшим G-белком в семействе Rho; он является ключевой нисходящей мишенью / эффектором PI3K и опосредует ключевые клеточные процессы в ответ на вышестоящие регуляторы, такие как факторы роста, интегрины и рецептор связывания HA (гиалуроновой кислоты) CD44 (см. выше). Напомню, что G-белки — это семейство белков, относящихся к ГТФазам (отсюда их название) и функционирующих в качестве вторичных посредников во внутриклеточных сигнальных каскадах. Чередование Rac1 между состояниями, связанными с GTP и GDP, существенно для эффективного потока сигналов, чтобы вызвать нисходящие биологические функции; здесь Rac1 играет роль бинарного транзистора с самостоятельным выходом. Rac1 может проходить циклы активации / инактивации при перемещении между плазматической мембраной и эндоцитическими компартментами.

При миграции клеток Rac1 иммобилизуется в нанокластеры по 50–100 молекул в каждом. Эти нанокластеры собираются из-за взаимодействия многоосновного хвоста Rac1 с фосфоинозитидными липидами PIP2 и PIP3. Дополнительные взаимодействия с GEF и, возможно, GAP, нижестоящими эффекторами и другими партнерами несут ответственность за обогащение нанокластеров Rac1 в выступающих областях клетки. Якорь Rac1 напоминает H-Ras в своем монопальмитоилировании (см. выше), при этом прямой рекрутинг и активация Rac1 в ранние фокальные адгезии, так наз. фокальные комплексы, происходят через GEF β-Pix, DOCK180, Trio, Vav2, Tiam1 и α-Pix в зависимости от типа клеток. Также непрямой рекрутинг и активация Rac1 в непосредственной близости от фокальных комплексов могут происходить через PIP3 анионные липиды. Механизм усиления работает следующим образом: активные Rac1 и PIP3 привлекают эффекторы, в частности GEF и GAP, к нанокластерам, они оказываются в ловушке и способны дополнительно удерживать и поддерживать активный Rac1. В результате этот механизм действует как положительная обратная связь Rac1.

Такие нанодомены уже наблюдались для других мембраносвязанных сигнальных белков. Так, для Ras было показано, что нанокластеры действуют как этап обработки сигнала, преобразуя аналоговые входы (концентрации лигандов) в цифровые (количество нанокластеров) и создавая другие аналоговые выходы (уровни внутриклеточных активных частиц), которые затем обрабатываются ниже по течению. Цифровизация уменьшает количество выходных состояний, но также уменьшает шум в системе, и компромисс между ними максимизирует передачу информации.

[albert52]

Продолжим.

В суперсемейство Ras входит более ста белков. На основе структуры, последовательности и функции надсемейство Ras делится на девять основных семейств: Ras, Rho, Rab, Rap, Arf, Ran, Rheb, Rad и Rit, каждое из которых далее делится на подсемейства. Каждое семейство имеет общий основной G-домен, который обеспечивает необходимую активность GTPase и обмена нуклеотидами. Грубо говоря, семейство Ras отвечает за пролиферацию клеток, Rap за клеточную адгезию, Rho за динамику цитоскелета и клеточную морфологию, Ran за ядерный транспорт, Rab и Arf за везикулярный транспорт и Rheb за передачу сигналов mTOR.

Члены суперсемейства Ras оказались критически важными игроками во множестве фундаментальных клеточных процессов, на которые они влияют путем модуляции их связывания GTP и цикла гидролиза. Обычно обнаруживается, что эти небольшие ГТФазы циклически переключаются между двумя пулами, мембранно-ассоциированным и цитозольным пулом. При этом прикрепление к мембране является предпосылкой для сигнальных ролей этих белков, поэтому обратимая мембранная транслокация предоставляет клеткам средства для регуляции места события активации.
Однако такой физический цикл имеет серьезные недостатки для небольших ГТФаз подсемейств Rho и Rab. В отличие от умеренной гидрофобности других членов суперсемейства Ras, модифицированных липидами, сильно гидрофобные геранилгеранильные фрагменты белков Rho и Rab делают их энергетически невыгодными для распределения в цитозоле в виде отдельных мономеров.

Посттрансляционно модифицированные белки Rho и Rab могут отделяться от мембран только в том случае, если им помогает «шаперон», который защищает объемные липидные фрагменты от водной среды цитозоля. Для белков Rho и Rab роль шаперона играют белки ингибиторы диссоциации гуаниновых нуклеотидов (GDI), Rho-GDI и Rab-GDI соответственно; димерные комплексы GDI/GTPase представляют собой цитозольный резервуар GTPase. Чтобы клетка использовала этот резервуар, сначала надо заставить GDI высвободить свою GTPase и факторы, которые способствуют замещению GDI и помогают рекрутировать GTPases на мембраны, имеют огромное значение, потому что они будут определять, где и когда активируются Rho и Rab GTPases.

Выявлены мембраносвязанные биохимические активности, опосредующие рекрутирование мембранных Rab-белков; ответственный объект был назван «GDF» для фактора смещения GDI. Так, Rab-взаимодействующий мембранный белок Yip3/Pra1 обладает активностью GDF для Rab9. При этом для Yip3/Pra1 было идентифицировано множество партнеров по связыванию; так рецептор нейротрофина регулирует RhoA, действуя как GDF.
Каждый GDI связывается с высокой аффинностью только с модифицированной липидами формой своего партнера, при этом каждый GDI представляет собой плейотропный фактор, способный взаимодействовать со многими различными членами одного и того же подсемейства. Т.о. один ген кодирует функцию Rab-GDI для каждого белка Rab, и аналогичным образом один ген обеспечивает функцию Rho-GDI для всех белков Rho.

Большинство белков семейства Rho циклически перемещаются между цитозолем и мембраной. Мембранная ассоциация опосредована встраиванием изопренильной части, расположенной на их С-конце, в липидный бислой. Перенос изопреноидного фрагмента из липидного бислоя в связывающий карман внутри RhoGDI непосредственно приводит к диссоциации белков Rho из мембраны с образованием растворимых частиц. Отметим, что RhoGDI преимущественно взаимодействуют со связанными с GDP формами цитозольных белков Rho, предотвращая спонтанное катализируемое GEF высвобождение нуклеотида GDP, тем самым поддерживая GTPases в неактивном состоянии. Кроме того, RhoGDI контролируют мембранную ассоциацию малых ГТФаз.

Также было выявлено несколько шаперонов Ras и Rap. Основные функции этих шаперонов заключаются в доставке фарнезилированных и геранилгеранилированных белков к мембранам и их извлечении из тех же компартментов. Изопренильные группы таких белков облегчают присоединение молекул к клеточным мембранам - это так наз.«липидные якорные белки». Впрочем одного только фарнезилирования или геранилгеранилирования недостаточно для нацеливания белков Ras или Rap на PM. Требуется второй механизм, включающий участок положительно заряженных основных аминокислот, PBR, который взаимодействует с отрицательно заряженными фосфолипидами PM. Кстати, изоформы Ras, особенно повсеместно экспрессируемые H, N и KRas (4A и 4B), в высокой степени гомологичны по своим последовательностям эффекторного G-домена, но существенно различаются по своим C-концевым 23–24 аминокислотам или так называемым HVR, включающий линкер плюс мембранный якорь с изопренильной группой.

~ 40% всех белков Ras существуют в виде мультимеров, каждый из которых состоит из 5–8 молекул Ras, и мультимеры Ras пространственно разделены в зависимости от изоформы и связанного нуклеотида. 10-20% молекул Ras присутствуют в димерах при экспрессии на уровне, близком к базовому, а фракция мультимеров более высокого порядка становится очевидной только при более высоких уровнях экспрессии .

Идентифицированные шапероны включают галектин-1, галектин-3, цГМФ- специфическая 6-дельта-субъединица фосфодиэстеразы (PDE6d) и малые GDS (SmgGDS). В то время как некоторые шапероны специфичны к одной ГТФазе (галектин-1 и галектин-3 являются специфическими шаперонами для H-Ras и K-Ras соответственно; PDE6d и SmgGDS способны связывать фарнезилированные Ras и геранилгеранилированные белки Rap, правда с разным сродством. Преимущественно связываясь с одной из GTPases, эти шапероны могут способствовать отличительной локализации Ras и Rap и, таким образом, регулировать сродство к сходным эффекторам.

PDE6d принадлежит к большому и разнообразному суперсемейству циклических нуклеотидов PDE (PDE1-11), основной функцией которого является регулирование клеточных концентраций цАМФ и цГМФ и создание сигнальных комплексов с регуляторными и каркасными белками. Отметим, что взаимодействие между GTPases и PDE6d регулируется PBR (см. выше); сходным образом, PBR также влияет на способность SmgGDS взаимодействовать с субстратами. Так, ассоциации SmgGDS с GTPases, лишенными PBR, ограничиваются неактивной формой GDP. Белок SmgGDS обладает необычно широкой субстратной специфичностью и он может стимулировать нуклеотидный обмен от нескольких малых GTPases, включая Rap1a, Rap1b, RhoA, K-Ras, Rac1 и Cdc42; различные варианты сплайсинга SmgGDS помогают вновь синтезированным малым GTPases достигать PM.

Фарнезилтиосалициловая кислота (FTS) — нетоксичный препарат, который изначально был разработан для воздействия на онкогенный и патологически активированный Ras; он препятствует связыванию активированных белков Ras с сопровождающими шаперонами и с PM. Несмотря на предпочтение формы, связанной с GTP, FTS не обладает специфичностью к отдельным малым GTPases. В дополнение к противораковым эффектам FTS продемонстрировал мощные противовоспалительные свойства на моделях аутоиммунных заболеваний, включая красную волчанку, аутоиммунный энцефалит, ревматоидный артрит и диабет I типа.

Белки 14-3-3 связываются с Raf-1 и подавляют его ферментативную активность, удерживая неактивную форму от БМ. Киназа Raf-1 может быть реактивирована путем вытеснения себя из белков 14-3-3 путем дефосфорилирования и связывания либо с белками Ras, либо с белками Rap. Таким образом, белки 14-3-3 регулируют функцию Ras и Rap, действуя как шапероны для Raf-1 и контролируя его ассоциацию с PМ; их можно рассматривать как малые скаффолды, впрочем как и Yip3/Pra1 (см. выше).
Название 14-3-3 относится к определенному характеру миграции этих белков при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и электрофорезе в крахмальном геле. Белки 14-3-3 играют критическую роль в специфических клеточных путях, включая клеточный цикл, экспрессию генов и апоптоз; более 200 связывающих белков взаимодействуют с ними.

[albert52]

Продолжим.

Белок Ran (родственный Ran или Ras-подобный ядерный) является единственным членом подсемейства Ran и наиболее распространенной малой ГТФазой в клетке. Как и другие малые GTPases, Ran действует как молекулярный переключатель, преобразуя между активной GTP-связанной и неактивной GDP-связанной конформациями. Однако Ran лишен мотива CAAX на своем С-конце, что является признаком других малых GTPases, которые обеспечивают локализацию на плазматической мембране и в основном перемещаются между ядром и цитоплазмой. Ran регулирует нуклео-цитоплазматический транспорт молекул через комплекс ядерных пор и контролирует развитие клеточного цикла посредством регуляции полимеризации микротрубочек и образования митотического веретена.

Комплекс ядерных пор (NPC) служит единственным двунаправленным шлюзом макромолекул в ядро ​​и из него. У человека каждый NPC состоит из ~1000 белковых субъединиц, называемых нуклеопоринами, и имеет общую молекулярную массу ~110 МДа, что делает NPC одним из крупнейших макромолекулярных ансамблей в клетках. NPC поддерживают целостность ядерного компартмента, предотвращая свободную диффузию макромолекул в ядро ​​или из него, но в отличие от большинства других мембранных переносчиков, NPC проводят грузы в их нативном состоянии. Это свойство позволяет макромолекулам действовать сразу после транспорта, например, во время передачи сигнала, чтобы активировать программу транскрипции.

NPC создает пассивный диффузионный барьер; макромолекулы размером менее 40 кДа могут пассивно диффундировать через диффузионный барьер, отдельные события диффузии происходят за доли секунды, а общий поток через отдельные NPC составляет от сотен до тысяч макромолекул в секунду. Отметим, что введение гидрофобных поверхностных остатков может позволить белкам, размер которых превышает предел, пассивно пересекать диффузионный барьер.

Нуклеоцитоплазматический транспорт большинства белков и некоторых клеточных РНК происходит Ran-зависимым образом. После образования в цитоплазме RanGDP быстро транспортируется в ядро ​​с помощью специального транспортера Ntf2, где он превращается в RanGTP под действием RCC1 , также также известного как RanGEF (фактор обмена нуклеотидов Ran Guanine). Таким образом, в клетке активно поддерживается градиент Ran, при этом уровень RanGTP в ядре примерно в 200 раз выше, чем в цитоплазме.
Грузы обычно обладают сигналами ядерной локализации (NLS) или сигналами ядерного экспорта (NES), которые распознаются членами семейства факторов ядерного транспорта кариоферин-β, хотя некоторые грузы также распознаются по их трехмерной (3D) складке или через адаптер-белки, такие как кариоферин-α. Отметим что кариоферины отвечают либо за ядерный импорт (импортины), либо за экспорт (экспортины); для экспорта требуется также белок XPO1. Селинексор — новый ингибитор XPO1, который ингибирует экспорт белков-супрессоров опухоли и мРНК онкобелков, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу в раковых клетках; селинексор в настоящее время одобрен FDA для лечения множественной миеломы.

При ядерном импорте комплексы кариоферин-груз подвергаются разборке при встрече с ядерным RanGTP. Напротив, во время ядерного экспорта RanGTP является обязательным компонентом экспортно-компетентных комплексов, которые по прибытии в цитоплазму разбираются, когда они сталкиваются с цитоплазмоспецифичными Ran-связывающими белками ((RanBP) и RanGAP (Ran- активирующим белком), которые взаимодействуют, чтобы активировать GTPase Ran. Активация GTPase приводит к превращению RanGTP в RanGDP, тем самым замыкая цикл Ran.

Ran может свободно диффундировать внутри клетки, но поскольку RCC1 и RanGAP расположены в разных местах клетки, концентрация RanGTP и RanGDP также различается локально, создавая градиенты концентрации, которые действуют как сигналы для других клеточных процессов. RCC1 связан с хроматином и поэтому располагается внутри ядра. RanGAP в клетках млекопитающих модифицирован SUMO и прикрепляется к цитоплазматической стороне комплекса ядерных пор посредством взаимодействия с нуклеопорином RANBP2 (Nup358).
Это различие в расположении дополнительных белков в цикле Ran приводит к высокому соотношению RanGTP к RanGDP внутри ядра и обратно низкому отношению RanGTP к RanGDP вне ядра; существует также градиент самого белка с более высокой концентрацией Ran в ядре, чем в цитоплазме. Цитоплазматический RanGDP импортируется в ядро ​​небольшим белком NUTF2 (Nuclear Transport Factor 2.

Во время митоза микротрубочки собираются в митотическое веретено для правильного выравнивания хромосом и разделения на две дочерние клетки. Считается, что сродство RCC1 к хроматину делает возможным образование градиентов RanGTP-RanGDP даже в митотических клетках, в которых отсутствует географическое подразделение ядра и цитоплазмы. Современные модели сборки митотического веретена постулируют, что градиент Ran играет глобальную роль в пространственной организации митотического аппарата и что RanGTP также действует локально, регулируя активность факторов сборки веретена и других белков.

Во время интерфазы факторы сборки веретена (SAF) направляются в ядро ​​через NLS и комплекс импортин-α/β и активируются только после Ran-GTP диссоциации («облако» RanGTP вокруг хромосом). К диссоциации также причастен нацеливающий белок X2 (TPX2), который увеличивает зарождение микротрубочек вблизи хромосом. Мутации в RCC1 и RanBP1 вызывают нарушение или даже остановку клеточного цикла из-за смещения микротрубочек и нарушения сборки митотического веретена или неправильного выравнивания хромосом на веретене.

Взаимодействие импортина β-Ran GTP и белка ядерного митотического аппарата (NuMA) устанавливает связь между передачей сигналов Ran и функцией NuMA и демонстрирует, что импортины могут изолировать NuMA, предотвращая его взаимодействие с микротрубочками, за исключением областей высокие концентрации Ran GTP. При этом позиция веретена во время деления клеток животных зависит от закрепления кортикальных микротрубочек посредством динеина и гигантского спирального белка NuMA .

[albert52]

Вставка.

Деление клетки.

Митоз представляет собой непрерывный процесс, но для удобства изучения биологи делят его на четыре стадии в зависимости от того, как выглядят в это время хромосомы в световом микроскопе. Профаза - самая продолжительная фаза митоза и занимает 0,60 времени от всего митоза, метафаза - 0,05 времени, анафаза - 0,05 и телофаза - 0,3 времени всего митоза. Длительность клеточного цикла разная у разных клеток, но постоянна для данной ткани. В профазе после распада ядерной оболочки хромосомы свободно и беспорядочно лежат в цитоплазме, а центриоли (в тех клетках, где они есть) расходятся к полюсам клетки. В конце профазы начинает образовываться веретено деления, которое формируется из микротрубочек путем полимеризации белковых субъединиц.

В интерфазной клетке центросома удваивается; при этом в большинстве животных клеток пара центриолей погружена в материал центросомы, от которого растут микротрубочки. В определенный момент фазы G1 две центриоли расходятся на несколько микрон.
В течение фазы S возле каждой старой центриоли под прямым углом к ней начинает формироваться дочерняя центриоль. Рост дочерних центриолей обычно завершается в фазе G2. Вначале обе пары центриолей остаются погруженными в единую массу центросомного материала, образующего одну центросому. В ранней фазе М каждая пара центриолей становится частью отдельного центра организации микротрубочек, от которого отходит радиальный пучок микротрубочек в виде звезды. Две звезды, первоначально лежавшие бок о бок около ядерной оболочки, теперь отходят друг от друга, а пучки полюсных микротрубочек, принадлежащие им и взаимодействующие между собой, избирательно удлиняются и центры расходятся по двум сторонам клетки. Таким способом быстро формируется митотическое веретено.

Астральные микротрубочки представляют собой субпопуляцию микротрубочек, которые существуют только во время и непосредственно перед митозом. Они определяются как любые микротрубочки, происходящие из центросомы, которые не соединяются с кинетохорой. Астральные микротрубочки развиваются в актиновом скелете и взаимодействуют с корой клеток, способствуя ориентации веретена.
Отметим что кинетохор собирается на центромере и связывает хромосому с полимерами микротрубочек из митотического веретена. Микротрубочки представляют собой длинные белковые нити с асимметричными концами, "минус" (-) конец относительно стабилен рядом с центросомой, а "плюс" (+) конец исследует центр клетки. Во время этого процесса поиска микротрубочка может столкнуться с хромосомой и захватить ее через кинетохор. Микротрубочки, которые находят и прикрепляют кинетохору, стабилизируются, тогда как те микротрубочки, которые остаются свободными, быстро деполимеризуются. Во время митоза каждая хроматида имеет свой собственный кинетохор, которые обращены в противоположные стороны и прикрепляются к противоположным полюсам веретена.

В метафазе завершается образование веретена деления, которое состоит из микротрубочек двух типов: хромосомных, которые связываются с центромерами хромосом, и центросомных (полюсных), которые тянутся от полюса к полюсу клетки. Каждая двойная хромосома прикрепляется к микротрубочкам веретена деления и хромосомы как бы выталкиваются микротрубочками в область экватора клетки, т. е. располагаются равном расстоянии от полюсов. Они лежат в одной плоскости и образуют так называемую экваториальную, или метафазную пластинку. В метафазе отчетливо видно двойное строение хромосом, соединенных только в области центромеры.

В анафазе дочерние хромосомы с помощью микротрубочек подтягиваются к полюсам клетки. Во время движения дочерние хромосомы несколько изгибаются наподобие шпильки, концы которой повернуты в сторону экватора клетки. этот момент в клетке находятся два диплоидных набора хромосом. Иногда в делящейся клетке образуется не два, а три или четыре полюса, что ведет к возникновению соответственно трех или четырех дочерних клеток.
Метафазная хромосома, состоящая из двух сестринских хроматид, может взаимодейвовать одновременно только с двумя полюсами. Если полюсов больше, то каждая хромосома вынуждена "выбирать", с какими двумя полюсами из трех или четырех ей взаимодействовать. Этот выбор совершается случайно и в результате каждая дочерняя клетка получает не весь набор хромосом, а только его часть, что наблюдается при хромосомной нестабильности (CIN); в опухолевых клетках выпадают обычно не целые хромосомы, а только их фрагменты (см. выше при описании опухолей толстой кишки).

В телофазе вокруг хромосом у каждого полюса из мембранных структур цитоплазмы формируется ядерная оболочка, в ядрах возникают ядрышки, а веретено деления разрушается.