Новая теория рака. 2-ая редакция

[albert52]

Продолжим.

Описано 2 различных генетических пути канцерогенеза в толстой кишке. Первый — это путь АРС/b-катенина, который связан с геном WNT и классической последовательностью аденома-карцинома. Второй — путь микросателлитной нестабильности, который связан с дефектом системы репарации ДНК. Оба пути приводят к постепенному накоплению многочисленных мутаций, но вовлеченные гены и механизмы, посредством которых накапливаются мутации, различны.

Классическая концепция развития КРР, предложенная B. Vogelstein, основана на возникновении его из традиционных аденом (тубулярных, ворсинчатых и тубуловорсинчатых) в результате активации Wnt сигнального каскада из-за инактивирующей мутации в гене APC (adenomatous polyposis coli), приводящей к активации генов KRAS/BRAF или активирующей мутации в гене, кодирующем β-катенин. Впрочем, активирующие мутации в онкогенах KRAS/BRAF могут быть первичными и появляться независимо от гена APC. Этот механизм канцерогенеза характерен для органов с интенсивным делением клеток. Для развития аденомы обе копии гена АРС должны быть функционально неактивными как вследствие мутации, так и из-за эпигенетических воздействий. При утрате функции АРС ß-катенин накапливается и переносится в ядро, где активирует транскрипцию генов MYC и циклина D1, которые активируют пролиферацию.

Wnt-сигнальный путь активирует транскрипционные факторы ядерного комплекса β-катенина и TCF/LEF (T cell factor/lymphoid enhancer factors), которые регулируют транскрипцию большого числа генов, вовлеченных в поддержание гомеостаза тканей, эмбриональное развитие. Также Wnt-сигнальный путь участвует в формировании нормальной слизистой оболочки толстой кишки.

Последующие дополнительные мутации, включая активирующие мутации гена Kras, приводят к активации роста и препятствуют апоптозу клеток. Мутация Kras является последним событием в цепи канцерогенеза. Это подтверждается тем, что эти мутации присутствуют только в 10% аденом диаметром менее 1 см, но обнаруживаются в 50% аденом диаметром более 1 см и в 50% инвазивных аденокарцином.

Прогрессирование опухоли также сопровождается мутациями других генов-супрессоров опухолей — SMAD2 и SMAD4, которые являются эффекторами сигнального пути TGF-ß. Поскольку сигнал TGF-ß в норме подавляет клеточный цикл, утрата этого гена может приводить к неконтролируемому клеточному росту.

Отметим еще фермент СОХ-2, высокая экспрессия которой определяется в 90% карцином толстой кишки и в 40-90% аденом толстой кишки. СОХ-2 необходима для выработки простагландина Е2, который стимулирует пролиферацию эпителия, особенно после его повреждения. Интересно, что экспрессия СОХ-2 регулируется TLR4, который распознает липополисахариды и также избыточно экспрессируется в аденомах и карциномах.

Мутации гена-супрессора опухолей р53 определяются в 70-80% случаев рака толстой кишки, но редко наблюдаются при аденомах, позволяя предположить, что мутации р53 возникают на поздних этапах прогрессирования опухоли. Причиной утраты функций р53 и других генов-супрессоров опухолей часто являются делеции, указывающие на то, что хромосомная нестабильность (chromosomal instability — CIN) — типичный признак пути АРС/Р-катенина.

Общая доля опухолей толстой кишки, возникших по данному механизму, составляет примерно 60 %. Этот путь характерен и для случаев с наследственным КРР и наследственным аденоматозным полипозом.
У пациентов с нарушением работы системы репарации ошибок репликации ДНК вследствие утраты генов, исправляющих эти ошибки (mismatch repair гены, MMR — MLH1 и MLH2), в микросателлитных последовательностях накапливаются мутации. Такое состояние называют микросателлитной нестабильностью (мутаторным фенотипом); она может быть высокой (MSI-H) или низкой (MSI-L), при ее отсутствии принято говорить о стабильности (MSS). Кстати, геном человека содержит 50-100 тыс. микросателлитов, длина которых увеличивается во время каждой репликации ДНК.

Эти мутации, как правило, являются «молчащими», т.к. микросателлиты обычно расположены в некодирующих участках ДНК. Однако некоторые микросателлитные последовательности располагаются в кодирующем участке или промоторной зоне генов, участвующих в регуляции клеточного роста, например генов рецептора TGF-ß II типа и проапоптотического белка ВАХ. TGF-ß, как я уже yпоминал, подавляет пролиферацию эпителиальных клеток толстой кишки, утрата его, а также ВАХ может повышать выживаемость генетически аномальных клеточных клонов. Здесь также часто определяются мутации онкогена BRAF, и сайленсинг (подавление транскрипции) различных групп генов вследствие гиперметилирования островков CpG.

Такие нарушения часто выявляют в плоских зубчатых аденомах, обычно в проксимальных отделах кишки; некоторые из них могут быстро прогрессировать в рак (малигнизироваться), несмотря на то, что размер их остается небольшим. При отсутствии аденоматозного строения такие образования считаются раком «de novo», а их патогенез называют «зубчатым путем канцерогенеза».

В целом такой метиляторный фенотип выявляется у 47—60% гиперпластических полипов, 75—77% SSA/P и 31—80% TSA. Микросателлитная нестабильность определяется у 64% гиперпластических полипов, 23—54% SSA/P и 30—56% TSA. В опухоли, развивающейся из TSA дистальной части толстой кишки, начальной является мутация гена KRAS, что встречается у 13—31% гиперпластических полипов, 3—12,5% SSA/P и 24—55% TSA. Следует отметить, что мутации в генах KRAS и BRAF являются взаимоисключающими.

Карциномы толстой кишки с мутацией BRAF имеют худший прогноз, чем Kras-мутантные, а колоректальные карциномы, развившиеся по зубчатому пути, требуют особого режима химиотерапии.

Такие опухоли, так же как и опухоли с метилированием островков CpG, часто локализуются в проксимальном отделе ободочной кишки. Но в целом общие гистологические характеристики аденокарцином дистального и проксимального отделов толстой кишки сходны. Большинство опухолей состоят из высоких цилиндрических клеток, напоминающих диспластичный эпителий, обнаруживаемый в аденомах.

Проведено иммуногистохимическое исследование аденокарциномы толстой кишки. При этом клеточный состав опухоли условно можно разделить на 4 популяции:
1) стволовые непролиферирующие (ALDH1+, Ki-67–);
2) стволовые пролиферирующие (ALDH1+, Ki-67+);
3) амплифицирующиеся (ALDH1–; Ki-67+);
4) дифференцирующиеся (ALDH1–; Ki-67–).
Соотношение данных популяций в среднем составляет 9:1:60:30.
Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей — пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Кроме того, часть клеток имеет экспрессию рецептора хемокина CXCR4, который в литературе при изучении других локализаций показывал связь с развитием метастазов.

Внутрислизистая карцинома развивается в том случае, когда диспластические эпителиальные клетки проникают через базальную мембрану в собственную или мышечную пластинку слизистой оболочки. Поскольку в слизистой оболочке толстой кишки отсутствуют лимфатические сосуды, внутрислизистая карцинома обладает очень низким метастатическим потенциалом, поэтому тотальная полипэктомия является эффективным методом лечения.

Низкодифференцированные опухоли и опухоли с муцинозной дифференцировкой имеют н***агоприятный прогноз, определяемый двумя наиболее значимыми факторами — глубиной инвазии опухоли и наличием метастазов в лимфоузлах. Инвазия в мышечную оболочку и метастазы в лимфатических узлах значительно снижают выживаемость.

[albert52]

Канцерогенные свойства определенных внешних факторов могут быть связаны исключительно с индукцией ими локального повреждения тканей и активации восстановления клеток, тем самым ускоряя клеточную пролиферацию, которая способствует трансформации клеток (см. выше). В этой модели риск рака органов определяется сочетанием факторов: врожденной пролиферативной способностью популяции стволовых клеток, инцидента локального повреждения тканей, вызывающего клеточную пролиферацию, и восприимчивости этих клеток к мутациям, которые могут трансформировать их в рак.

Как и нормальные стволовые клетки, раковые стволовые клетки (CSC) обладают мультилинейным потенциалом дифференцировки и дают начало иерархично организованной клеточной популяции. Увеличение популяции самих CSC осуществляется благодаря преобладанию их симметричного деления (приводящему к образованию 2 дочерних клеток) над ассимметричным (в результате которого образуется 1 дочерняя CSC и 1 дифференцированная клетка). CSC демонстрируют высокий уровень экспрессии белков, принадлежащих семейству мембранных ABC транспортеров, вовлеченных в обеспечение резистентности к химиотерапии (ХТ).

По аналогии с теориями возникновения CSC (или нормальная стволовая клетка, или нормальная дифференцированная клетка) существуют 2 возможные теории развития рака толстой кишки: «восходящая» и «нисходящая». Первая предполагает развитие КРР из стволовой клетки, находящейся в базальном отделе крипты, в результате аномальной дифференцировки в направлении CSC. В пользу этой теории говорит идентификация специфических генов, характерных для кишечных стволовых клеток, в предшествующих аденомах.

Сторонники «нисходящей» теории руководствуются гистологическими проявлениями аденомы толстой кишки, такими как дисплазия/неоплазия эпителия и повышенная экспрессия Ki-67, наблюдаемыми в вершине ворсинок при интактных клетках базальных отделов. Маркер Ki-67 свидетельствует об интенсивности пролиферативных процессов.

РНК-связывающий белок Msi-1 был первой молекулой, обнаруженной в предполагаемых кишечных стволовых клетках. Показано, что Msi-1 подавляет экспрессию генов, специфичных для клеток Панета, в кишечных стволовых клетках, причем его сигнальный путь отличен от Wnt и Notch – главных путей, участвующих в дифференцировке клеток Панета. Эти данные указывают на то, что роль Msi-1 может заключаться в поддержании кишечных стволовых клеток в недифференцированном состоянии.

В 1990 г. в Y-хромосоме впервые был обнаружен фактор, детерминирующий развитие яичка у млекопитающих. Ген Sry, кодирующий данный фактор, содержит домен HMG (high-mobility group), который обеспечивает точное узнавание и связывание ДНК. Белки, содержащие HMG-домен, с аминокислотной последовательностью, повторяющей как минимум на 50 % последовательность HMG гена Sry, называют Sox-белки. Функции этих белков разнообразны: включают регуляцию эмбрионального развития и поддержание гомеостаза стволовых клеток во взрослом состоянии.

Sox2 играет ключевую роль в поддержании пула стволовых клеток и является необходимым фактором для репрограммирования соматических клеток по пути плюрипотентности. Sox2 участвует в развитии большого количества типов злокачественных новообразований и является маркером CSC. Для рака пищевода и легкого наличие Sox2 служит прогностическим маркером.

Реакция Sox2 в норме имеет ядерную локализацию. В нормальной слизистой оболочке толстой кишки экспрессия Sox2 чаще всего отсутствует. Вообще-то Sox2 играет большую роль в развитии верхнего, но не нижнего отдела пищеварительного тракта. Sox2 уменьшает экспрессию Е-кадгерина на плазматической мембране, что приводит к снижению связывающей способности адгезивного комплекса к β-катенину. Подавление транскрипции Sox2 приводит к ингибированию Wnt-сигнального пути у пациентов с КРР (раком толстой кишки).

Подавление транскрипции Sox2 приводит к достоверному снижению активности белка MMP2 (матриксная металлопротеиназа 2) и, как следствие, уменьшению клеточной миграции и подвижности. У больных раком толстой кишки с сильной реакцией Sox2 процент метастазов в печень и регионарные лимфатические узлы (ЛУ) был вдвое выше, чем у пациентов с отрицательной реакцией Sox2.

Альдегиддегидрогеназа 1 (aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1) – детоксифицирующий фермент, который окисляет внутриклеточные альдегиды и превращает ретинол в модулятор пролиферации – ретиноевую кислоту. Гиперэкспрессия ALDH1 обеспечивает устойчивость к алкилирующим агентам и защиту стволовых клеток от окислительного стресса, способствуя увеличению их существования. Наблюдалась корреляция между высоким уровнем экспрессии изоформы ALDH1 и н***агоприятным прогнозом.

CD24 – маленькая, сильно гликозилированная муциноподобная адгезивная молекула, состоящая из 27 аминокислот. Она заякоривается на клеточной мембране и в норме экспрессируется в развивающейся поджелудочной железе и мозге, пре-B-лимфоцитах, регенерирующей мышце, нормальных кератиноцитах и почечных канальцах. CD24 экспрессируется большим количеством злокачественных солидных опухолей, в том числе клетками рака толстой кишки. Есть данные о повышенной экспрессии CD24 РНК при КРР в опухолевых клетках по сравнению со слабым уровнем в окружающей интактной слизистой оболочке.

Белок CD44 – член семейства трансмембранных белков, насчитывающий как минимум 20 вариантов, образующихся из одного гена в результате альтернативного сплайсинга и посттрансляционных модификаций. CD44 является адгезивным белком, который участвует во взаимодействиях клетка–клетка и клетка–межклеточный матрикс посредством своего лиганда – гиалуроновой кислоты.

CD44 считается маркером CSC некоторых солидных опухолей, в том числе молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака печени, немелкоклеточного рака легкого и КРР. Установлено, что только CD44-положительные клетки способны запоминать морфологические и фенотипические свойства опухоли, из которых они были выделены.

CD44 необходим для поддержания «стволовости» колоректальных CSC. Маленькие кластеры инвазивных клеток в аденокарциномах часто активно экпрессируют CD44, что свидетельствует об их недифференцированном состоянии.

[albert52]

Вернемся к молекулярной биологии клетки. TOR - это внутриклеточный белок, на котором сходятся многие сигнальные пути от рецепторов, расположенных на поверхности клетки. Молекулярный комплекс mTOR называется мишенью рапамицина у млекопитающих и относится к протеинкиназам. В клетке он существует как субъединица внутриклеточных мультимолекулярных сигнальных комплексов mTORC1 и mTORC2.

Эта система работает в ответ на появление питательных веществ, ростовых факторов, цитокинов и прочих важных для клеток молекул и в ответ на все это регулирует размножение клетки, ее форму, движение, выживание, синтез белков и другие функции. Нарушение регуляции mTOR приводит к развитию различных заболеваний, в том числе и различных типов рака.

Подавление сигнального пути mTORC1 приводит к активации регуляторных белков СКН-1 и DAF-16; эти белки контролируют экспрессию генов, защищающих от метаболического и протеотоксического стресса, а также от стресса, вызванного воздействием факторов окружающей среды. Вообще в целом существует гомеостатическая связь между синтезом белков и защитой от стресса: если синтез белков снижается, защита от стресса усиливается.

Опосредованный TOR механизм известен как своего рода «топливный датчик», реагирующий на доступность питательных веществ изменением эффективности синтеза белков. В частности TOR регулирует ответ клетки на наличие или отсутствие аминокислот — одного из важных компонентов нашей пищи. Питательные вещества передают сигнал mTORC1 через ассоциированные с лизосомами Rag GTPases и их многочисленные регуляторы, а также цитозольные и лизосомальные сенсоры питательных веществ.

Многие из негативных эффектов, ассоциируемых со старением, являются результатом избыточных клеточных функций. Другими словами, наши клетки и наши внутренние системы работают слишком хорошо. Или слишком интенсивно. Очевидным примером этого является рак: вместо того чтобы умереть, раковые клетки растут и делятся до бесконечности – благодаря гиперактивированным путям TOR.

Также многие аспекты старения вызываются не ослаблением, а неконтролируемой активностью клеточных функций. «Мы запрограммированы на то, чтобы функционировать на максимальных уровнях, поскольку это дает массу преимуществ в начале жизни. После того как рост завершен, "автомобиль" покидает автостраду и заезжает на парковку, где ему следует плавно притормозить и остановиться. Однако этого не происходит – он продолжает носиться по парковке со скоростью 100 км/ч и в результате разрушает сам себя. Старение не запрограммировано, это лишь "квази-программа": бесполезное продолжение программы развития.

В прошлом это не имело большого значения, поскольку подавляющее большинство людей умирали в возрасте до 50 лет, не доезжая до «парковки». Теперь до нее добираются очень многие, и гиперфункция становится реальной проблемой. Именно из-за гиперфункции у 25 % женщин старше 70 лет развивается рак молочной железы (по сравнению всего с 2 % у женщин младше 40 лет). Именно из-за гиперфункции у женщин старше 50 продолжают накапливаться жировые отложения, предназначенные для вынашивания и кормления детей, которых немолодые женщины больше не могут иметь.

И именно из-за гиперфункции у мужчин в пожилом возрасте продолжает расти предстательная железа, что является главной причиной трудностей с мочеиспусканием и рака простаты. Именно из-за гиперфункции с возрастом волосы начинают расти у нас в ушах, а не на голове. И именно из-за гиперфункции на клеточном уровне наши клетки продолжают расти, стареть и отравлять все вокруг себя.

Продукты питания имеют разное влияние на активность mTOR. Есть нейтральные продукты, которые стимулируют mTOR пропорционально числу калорий, а есть «быстрые» продукты, которые стимулирую mTOR намного сильнее. Постоянно увеличивающееся сигнализирование mTORС1 признано основной движущей силой развития mTORС1-зависимых болезней цивилизации. Клетка реагирует на многие стимулы (факторы роста, питательные вещества, гормоны и др.), в итоге активируется ферментный комплекс mTOR.
Основные пути активации (не все!).
1. Гормоны и факторы роста: тестостерон, орексин, инсулин, ИФР-1 (IGF-1 – инсулиновый фактор роста) и др.
2. Нутриенты (пищевые элементы) и режим питания: общая калорийность, частота приемов пищи, углеводная нагрузка, сахар, аминокислоты (БЦАА и метионин). Коровье молоко - это чрезвычайно мощная эволюционная программа быстрого роста, которая может перманентно индуцировать чрезмерную стимуляцию mTORC1 у людей, употр***яющих молоко.
3. Физические упражнения. mTOR активируется в мозгe, мышцах и сердце, ингибируется в печени и жировых клетках, что несет пользу для организма.
4. Воспаление (избыток омега-6 жирных кислот, нарушенная микрофлора и др.)
5. Определенные вещества, например фосфорная кислота.

Быстрые продукты содержат нутриенты, которые максимально сильно стимулируют mTOR pазными механизмами: через глюкозу, через ИФР-1, через режим кормления (Чем чаще ест, тем сильнее вырабатывается ИФР-1 даже при одинаковом числе калорий), через действие лейцина и множеством других механизмов. Классическим быстрым продуктом является молоко и продукты из него (сыр, творог, сухое молоко и др.).

Самая быстрая аминокислота – лейцин. Лейцин (сокр. Leu или L; 2-амино-4-метилпентановая кислота; от греч. leukos — «белый»), входит в состав всех природных белков. Лейцин является одной из незаменимых аминокислот, которая не синтезируется клетками организма, поэтому поступает в организм исключительно в составе белков натуральной пищи. Его можно найти в молочных продуктах, мясе, пшенице, бобовых, орехах, коричневом рисе и продуктах из цельного зерна. Лейцин составляет около восьми процентов всех аминокислот в организме и это четвертая аминокислота по концентрации в мышечных тканях.

Лейцин обладает уникальным свойством напрямую стимулировать активность mTOR. Кроме того, лейцин стимулирует выделение инсулина и ИФР-1, которые также стимулируют mTOR. mTOR весьма чувствителен к концентрации лейцина, который оказывает приблизительно в 10 раз большее влияние на образование новых белков, чем любая другая аминокислота!

[albert52]

Продолжим.

Как mTORC1, так и mTORC2 содержат несколько общих компонентов: киназу mTOR, которая действует как центральный каталитический компонент, каркасный белок mLST8, регуляторная субъединица mTOR DEPTOR и комплекс Tti1 / Tel2, который важен для сборки и стабильности комплекса mTOR.

Кроме того, каждый комплекс содержит отдельные субъединицы, которые способствуют субстратной специфичности, субклеточной локализации и сложной специфической регуляции. mTORC1 определяется его ассоциацией с Raptor, каркасным белком, важным для сборки, стабильности, субстратной специфичности и регуляции mTORC1, и PRAS40, фактором, который блокирует активность mTORC1 до тех пор, пока передача сигналов рецептора фактора роста не снимет опосредованное PRAS40 ингибирование mTORC1.

Недавно обнаруженная структура mTORC1 показывает, что он действует как димер в форме ромба, причем киназные домены находятся в непосредственной близости друг от друга в центре структуры, а Raptor и mLST8 связываются на периферии.

mTORC2 также разделяет киназу mTOR, mLST8, Tti / Tel2 и DEPTOR, но содержит уникальные компоненты Rictor и mSin1. Рапамицин является известным аллостерическим ингибитором mTORC1, тогда как ингибиторы киназы TOR (TOR-KI) подавляют активность обоих комплексов. mSin1 является ключевым негативным регулятором активности киназы mTORC2 до тех пор, пока передача сигналов, производных от рецептора фактора роста через фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), не привлекает mSin1 / mTORC2 к плазматической мембране, где опосредованное Sin1 ингибирование mTORC2 не снимается.

Активный mTORC2 тесно связан с плазматической мембраной и был обнаружен в связи с рибосомными мембранами, где он может взаимодействовать со своими ключевыми субстратами, киназами AGC, включая AKT1-3, serum-glukokortikoid-regulierte kinase или serine/threonine-protein kinase (SGK), и члены семейства протеинкиназы C (PKC). Напротив, mTORC1, по-видимому, связан с эндосомными и лизосомальными мембранами, где он взаимодействует со своими эффекторами 4EBP1 и S6K1.

Некоторые стимулы передают сигнал через комплекс туберозного склероза (TSC; включая TSC1 и TSC2). TSC представляет собой GTPase-активирующий белок (GAP) для небольшой протеaзы RHEB (Ras homolog enriched in brain) и отрицательно регулирует mTORC1, способствуя гидролизу RHEB_GTP, превращая RHEB в его неактивное состояние.

Прямые доказательства активности mTORC1 в канцерогенезе исходят от туберозного склероза, заболевания, вызванного потерей TSC1 или TSC2, что приводит к гиперактивации mTORC1 и приводит к широко распространенному, но доброкачественному образованию опухоли. Ограниченное прогрессирование этих опухолей может быть связано с опосредованной mTORC1 отрицательной обратной связью по субстрату рецептора инсулина (IRS) -1, сильно подавляющей передачу сигналов PI3K ниже большинства рецепторных тирозинкиназ (RTK).

mTORC1 является основным регулятором рибосомного биогенеза и синтеза белка посредством фосфорилирования и активации S6K, а также фосфорилирования и инактивации репрессоров трансляции мРНК 4EBP1. Впрочем S6K1 (фосфорилирует S6 -рибосомный белок 40S S6, усиливая трансляцию мРНК ) также может активироваться TOR-нечувствительными сигнальными путями, такими как PDK1, MAPK и SAPK (стресс-активируемая протеинкиназа), но все три сайта фосфорилирования могут блокироваться ингибиторами mTOR.

Имеются данные о том, что mTORC1 регулирует аэробный гликолиз за счет увеличения трансляции фактора, индуцируемого гипоксией (HIF -1α), фактора транскрипции, который управляет экспрессией нескольких гликолитических ферментов. Шунтирование промежуточных продуктов гликолиза в синтез нуклеотидов также частично контролируется mTORC1. mTORC1-обусловленное фосфорилирование S6K1 стимулирует синтез пурина и пиримидина, который необходим для раковых клеток , чтобы быстро дублировать их ДНК.

mTORC1 активирует синтез липидов из промежуточных продуктов гликолиза посредством фосфорилирования Lipin1 и S6K1, таким образом активируя фактор связывания регуляторного элемента транскрипции (SREBP -1), управляя транскрипцией генов, участвующих в липогенезе. Потеря mTORC1-опосредованной активации SREBP1 в клетках рака молочной железы блокирует липогенез, препятствуя пролиферации клеток и росту опухоли.

mTORC1 также негативно регулирует лизосомную деградацию внеклеточного белка, поглощаемого макропиноцитозом, и косвенно регулирует аутофагию, контролируя биогенез лизосом посредством фосфорилирования фактора транскрипции EB (TFEB), который управляет транскрипцией нескольких генов, специфичных для лизосом и аутофагии. mTORC1 и TFEB совместно локализуются на лизосомной мембране, где mTORC1-обеспечиваемое фосфорилирование способствует цитоплазматической секвестрации TFEB.

[albert52]

Вставка 6

У эукариотических клетках лизосомы являются пищеварительными центрами, где биологические макромолекулы разрушаются в результате фагоцитоза и аутофагии, тем самым поддерживая способность клеток к самообновлению и снабжение энергией. Лизосомы также служат в качестве сигнальных узлов для мониторинга внутриклеточных уровней питательных веществ и энергии, выступая в качестве платформ для сборки множества сигнальных путей, таких как мишень рапамицина 1 (mTORC1) у млекопитающих и активирующую AMP киназу (AMPK). Лизосомная дисфункция связана с различными заболеваниями человека.

Лизосомы представляют собой однослойные мембранные органеллы, окруженные липидной мембраной толщиной 7–10 нм. Лизосомная мембрана состоит как из первичных лизосом, секретируемых Гольджи, так и из везикул плазматической мембраны и эндоцитарного пути. Недавно синтезированные белки, нацеленные на лизосомы, могут транспортироваться либо непосредственно в лизосомы через сеть транс-Гольджи или косвенно попадает в просвет путем эндоцитоза.

H + -ATPase мембранного вакуолярного типа (V-ATPase) является отличительной характеристикой лизосом и может непрерывно перекачивать H + в лизосомы для поддержания кислой среды. LAMP ( лизосом-ассоциированные мембранные белки ) составляют 80% белков лизосомальной мембраны, защищая лизосомальную мембрану от кислотного переваривания через их сильно гликозилированные внутриполостные части. Лизосомные транспортеры необходимы для транспортировки конечных продуктов в цитоплазму для дальнейшего метаболического использования .

В условиях обогащения питательными веществами Rag GTPases, гетеродимеры, образованные RagA/B и RagC/D, активируются и привязываются к лизосомной мембране, дополнительно рекрутируя mTORC1. Rag GTPases могут активироваться Ragulator и ингибироваться комплексом GATOR1. Ragulator - это каркасный белок; белковые каркасы в клетке включают в себя самые разнообразные наборы ферментов, взаимодействие которых необходимо для функционирования клетки. Ragulator активируется SLC38A ( предполагаемым натрий-зависимым аминокислотно / протонным антипортером ) и лизосомальной V-АТФазой, которые в свою очередь стимулируются аргинином и лейцином соответственно в просвете лизосом, в то время как комплекс GATOR1 ингибируется GATOR2, который стимулируется аминокислотами в цитоплазме (комплексы GATOR1 и 2(Gap Activity TOward Rags) участвуют в восприятии аминокислот). Затем mTORC1 активируется GTPases Rheb, стимулированной GF (фактором роста ) посредством ингибирования TSC.

При дефиците глюкозы каркасный белок аксин вызывает диссоциацию и инактивацию mTORC1 посредством ингибирования Ragulator. Кроме того, аксин рекрутирует AMPK, взаимодействуя с LKB1, и вызывает активацию AMPK, образуя комплексы с V-ATPase и Ragulator.

Аутофагия характеризуется везикулами, поглощающими цитоплазматические белки или органеллы и последующим слиянием с лизосомами для деградации содержимого, что важно для внутриклеточного метаболического гомеостаза и обновления определенных органелл. Как правило, аутофагия подразделяется на макроаутофагию, микроаутофагию и шаперон-опосредованную аутофагию (CMA).

В отличие от макроаутофагии, которая называется генерализованной аутофагией, аутофагосомы не образуются во время микроаутофагии; вместо этого лизосома непосредственно поглощает микроаутофаги через углубление, выпуклость или разделение лизосомных мембран. При CMA шаперон связывается и транспортирует целевой белок в лизосомы для деградации. Белок теплового шока (Hsp70), молекулярный шаперон, который играет критическую роль в CMA, способен узнавать и связывать субстраты для деградации лизосом.

Кроме того, Hsp70 способствует мультимеризации LAMP типа 2a, лизосомального рецептора, участвующего в CMA, с образованием комплекса транслокации, в котором дополнительно формируется канал транслокации, через который разрешается проходить только развернутым субстратам. Точно так же в CMA требуются другие молекулярные шапероны, в том числе Hsp90, который регулирует стабилизацию транслокационного комплекса, Hsp40, Hsp70-взаимодействующий белок (Hip) и Hsp70-Hsp90-организующий белок (Hop), который облегчает процесс транслокации.

Лизосомный контроль качества (LQC) включает лизосомную репарацию, лизофагию и лизосомную регенерацию и быстро запускается в ответ на повреждение лизосом для поддержания структурной целостности лизосом и функционального гомеостаза. Поврежденную лизосомную мембрану можно восстановить с помощью Hsp70 и ESCRT. При лизофагии поврежденные лизосомы в конечном итоге транспортируются в нормальные лизосомы для деградации через фагосомы, образованные фагофорами. Ингибирование mTORC1 за счет потери лизосом может позволить TFEB связываться с CLEAR и способствовать образованию лизосом.

Эндосомальные сортировки комплексов, необходимые для транспортировки (ESCRT), имеют решающее значение для ремонта поврежденных лизосомальных мембран. ESCRT - это высококонсервативная транспортная система, запрограммированная на транспортировку убиквитинированных белков в лизосомы. ESCRTs могут восстанавливать небольшие перфорации в лизосомальной мембране на ранней стадии лизосомного повреждения и рекрутируются всего за несколько минут.

Подобно селективной аутофагии, убиквитинирование поврежденных лизосом является основным фактором, управляющим и модулирующим лизофагию.

В физиологических условиях количество лизосом постоянно поддерживается за счет динамического гомеостаза, сбалансированного между образованием и деградацией. Промоторные области многих лизосомных генов содержат один или несколько повторов мотива из 10 пар оснований (GTCACGTGAC), известных для координации лизосомальной экспрессии и регуляции (CLEAR) элементов. TFEB, член семейства MiT / TFE, напрямую связывается с элементом CLEAR и дополнительно способствует обновлению лизосом. Вообще, TFEB вносит вклад в уровни экспрессии большого количества генов, участвующих в лизосомной функции, включая экзоцитоз, фагоцитоз, эндоцитоз и аутофагию.

Ингибирование mTOR делает возможным дефосфорилирование и транслокацию TFEB, что затем увеличивает экспрессию генов, кодирующих лизосомные белки, такие как V-ATPases, лизосомные трансмембранные белки и гидролазы.

В настоящее время широко признаны два основных пути, опосредующих
апоптоз, а именно экзогенный апоптоз через рецепторы смерти на поверхности клеток и внутренний апоптоз, зависящий от вовлечения митохондрий. Лизосомное повреждение запускает апоптоз по эндогенному пути, при этом утечка лизосомальных ферментов из поврежденных лизосом имеет решающее значение для апоптоза в митохондриально-зависимом пути. Интересно, что высвобождение H2O2 из поврежденных митохондрий также объясняет фрагментацию лизосомных мембран. Кроме того, катепсины лизосом способны расщеплять Bcl-2, тем самым приводя к ускорению апоптоза.

Лизосома является одним из основных мест хранения железа и важна для поддержания уровней внутриклеточных АФК и железа. При воздействии H2O2 свободное железо в лизосомах увеличивает производство ROS, которые затем могут высвобождаться через нестабильную лизосомную мембрану, чтобы запустить активацию путей гибели клеток. Большая часть железа находится в форме, подходящей для связывания с ферритином в цитоплазме, который может расщепляться путем лизосомальной аутофагии, вызывая высвобождение активного железа.

Общепринято, что лизосомы имеют решающее значение для инициации и рецессии воспалительных реакций. Так, при гиперурикемии мочевая кислота перенасыщается в моче и образует кристаллы мочевой кислоты, которые транспортируются в лизосомы за счет эндоцитоза эпителиальных клеток почечных канальцев, разрушая лизосомальную мембрану и вызывая разрыв лизосомы, в свою очередь, приводя к воспалению почек. Точно так же сосуществование лизосом и пищеварительных ферментов в ацинарных клетках поджелудочной железы считается ранним событием при остром панкреатите.

[albert52]

Из всех злокачественных опухолей наиболее показательной в отношении значения TOR пути является меланома. Меланома кожи является результатом неопластической трансформации меланоцитов – клеток, продуцирующих различные вариации пигмента меланина. Эти клетки происходят из меланобластов, судьбу которых сложно назвать предопределённой: данный элемент впоследствии может развиться в нейрон, лейомиоцит, а в случае высокого уровня меланоцит-глиального потенциала – и в компонент глии. После дифференцировки в меланоците выделяют тело (сому) и отростки, которые располагаются в базальном и шиповатом слоях эпидермиса соответственно .

Под действием меланоцитстимулирующих и адренокортикотропного гормонов, а также солнечного света в меланосомах синтезируется (эу)меланин (и феомеланин), функцией которого является защита ядерного аппарата клетки от повреждения УФ-излучением. Синтезированный меланин транспортируется в шиповатый слой эпидермиса по отросткам меланоцита, далее в кератиноциты эпидермиса, придавая коже загар . Спустя некоторое время данный полимер гидролизируется в лизосомах, а коже возвращается её привычный оттенок.

На сегодняшний день заболеваемость меланомой увеличивается во всех странах мира; медиана выживаемости при меланоме составляет не более 8-ми месяцев, а эффективность радикального хирургического лечения не превышает 5-6%. Средний возраст заболевших меланомой кожи составляет примерно 45 лет, однако за последние годы меланома стала всё чаще возникать у совсем молодых людей (15-25 лет). Эта опухоль встречается у мужчин и женщин, причём у женщин в 1,5-2 раза чаще. По статистике, на каждые 100.000 здоровых человек приходится 14 больных с меланомой.

Согласно статистике ВОЗ, чернокожие в 4 раза реже страдают от меланомы, чем европеоиды, то есть чем выше природное количество меланоцитов в коже, тем ниже риск возникновения меланомы, следовательно, низкий уровень пигментации является фактором риска. Другим фактором риска является наличие большого количества веснушек на коже, которые обусловлены скоплением пролиферирующих меланоцитов в базальном слое эпидермиса и эпителии наружных отделов волосяных фолликулов.

При меланоме наиболее заметным является МАРК (mitogen-activated protein kinase) кластер, к которому относятся внутриклеточные сигнальные пути самых разнообразных функций . Критерием для включения в МАРК-группу является наличие митоген-активируемых протеинкиназ в модуле, в котором, помимо киназ, содержатся протеинфосфатазы и белки-сборщики белковых вспомогательных комплексов (каркасные белки - см. выше).

Среди множества киназ, задействованных при передаче сигнала, в кластере МАРК существуют так называемые Raf-киназы. Raf- – это семейство серин-треонин зависимых протеинкиназ, название которых является акронимом от Rapidly Accelerated Fibrosarcoma. Из них наибольший интерес здесь представляет B-raf (BRAF), который кодируется одноименным геном; возникающая под действием чрезмерного УФ-облучения в данном гене V600 мутация, заключающаяся в замене валина на лейцин (V600L), лизин (V600K) или глутаминовую кислоту (V600E) в 600-ой позиции, служит стартером неопластической трансформации в меланоме кожи, а также является мишенью для действия лекарственных средств, объединенных в группу ингибиторов BRAF V600L. Это так называемые «-нибы»: иматиниб, сорафениб, вемурафениб и т.п.

При использовании этих лекарств надо помнить, что если при верифицированном мутированном BRAF-статусе пациента низкомолекулярные ингибиторы BRAF приводили к торможению развития меланомы, то потр***ение «-нибов» пациентами, мутации BRAF у которых вызывали сомнения либо отсутствовали, приводило к мутации другого каскада - RAS-RAF-MEK-ERK, патологически активируя его и инициируя неопластическую трансформацию. Впрочем при мутации V600E в любом случае происходит усиление сигналинга ERK в результате димеризации мутантной киназы (здесь помогает препарат вемурафениб (зелораф); в основе его действия лежит ингибирование димеризации BRAF).

В январе 2014 г. зарегистрирован новый таргетный препарат дабрафениб, который действует не только при замене V600E, но и при мутации V600K. К сожалению, практически у всех пациентов, ответивших на вемурафениб, с течением времени появляется устойчивость к терапии.

МЕК (mark-epk-kinase) также является серин-треониновой киназой МАРК-кластера и интегрирует сигналы от различных факторов роста с последующей активацией пролиферации. МЕК участвует в регуляции активности транскрипционных факторов (ТФ), таких как, например, C-myc. Белок Myc, кодируемый одноимённым геном и являющийся протоонкогеном, является не только «каноничным» примером ТФ, но и контролирует структуру хроматина, регулируя ацетилирование гистонов, что в свою очередь влияет на активность экспрессии генов. Мутантный ген Mус, находящийся в 8-ой хромосоме, обнаруживается во многих видах опухолей; классическим примером является транслокация t (8;14), приводящая к возникновению и развитию лимфомы Бёркитта .

N-RAS (Neuroblastoma-Ras) – ген, кодирующий одноименный белок, входящий в так называемое суперсемейство Ras – малых ГТФ-аз . Наряду с NRAS в данное семейство входят гены K-Ras, H-Ras (вызывающие неопластическую трансформацию при заражении вирусом саркомы Кристен и Харви соответственно) и др. На сегодняшний день функция NRAS определена как передача пролиферативных сигналов от рецепторов факторов роста. N-RAS, как и все суперсемейство, задействованы в сигнальном пути МАРК.

Последним рассматриваемым здесь звеном МАРК-каскада является ген c-KIT. Последним, но не по значению: мутации этого гена, являющегося протоонкогеном, белок которого является рецептором факторов роста стволовых клеток, выявляются в каждом третьем случае меланомы различных локализаций: как кожи, так и слизистых. Отметим, что Kit-мутация успешно ингибируется уже известными по таргетной терапии BRAF-положительных меланом «-нибами».

[albert52]

Следующим компонентом пролиферативных сигнальных путей, патологически активированных в клетках меланомы, является PI3K – фосфоинозитол-3-киназный путь, нередко обозначаемый в литературе как «сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR», также активируемый белком Ras. Его активация наблюдается примерно в 40-70% случаев меланомы, и наиболее часто это происходит в результате нарушения функционирования каскада, регулируемого супрессором фосфатаз PTEN (phosphatase and tensin homolog).

Это каскад реакций, основные события которого разворачиваются вокруг следующих ферментов: фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), семейства протеинкиназ В, компонентами которого являются серин-треонин киназы АКТ 1, 2, 3, и ещё одной серин-треонинспецифичной киназы, обозначаемой как mTOR. В контексте канцерогенеза в клетках меланомы кожи наибольший интерес представляют компоненты AKT и PTEN.

PTEN представляет собой фосфатазу липидов, ферментативная активность которой служит прежде всего для удаления фосфатных групп из PI3К/Akt. Это обычно ограничивает рост и продукцию сигналов выживания клеток. Утрата опухолью супрессорной активности PTEN, выявляемая в значительном числе меланом, ведет к инактивации супрессорных биохимических каскадов, постоянной активации противоапоптотической протеинкиназы В/Аkt и в итоге - к блокированию апоптоза и неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Инактивация PTEN обнаруживается во многих опухолях, поскольку приводит к неконтролируемому делению с утратой дифференцировки, сбоям в метаболизме клетки и извращённому синтезу. Инактивирующие PTEN мутации обнаруживаются в 10-30% меланом.

Семейство АКТ представляет собой группу киназ, которые путём присоединения остатков фосфорной кислоты к различным белкам цитозоля контролируют их активность. Данное семейство выполняет как классические функции, например, регуляцию пролиферации, дифференцировку и изменение цитоскелета, так и щекотливые в контексте канцерогенеза функции ангионеогенеза, ухода от апоптоза и приобретения резистентности к цитостатикам.

В семейство АКТ входит 3 подвида протеинкиназ: АКТ-1, АКТ-2 и АКТ-3, являющихся продуктами соответствующих генов:
- Akt1 - α-серин/треониновая протеинкиназа – ингибирование апоптоза, биосинтез белка (в сторону «плюс-ткани», гипертрофия миоцитов и т.п.).
- Akt2 - ß -серин/треониновая протеинкиназа- участвует в метаболизме инсулина, индуцирует транспорт глюкозы, осуществляемый ГЛЮТ-4.
- Akt3 - γ- серин/треониновой-протеинкиназы – функция достоверно неизвестна.
Различные виды АКТ гиперэкспрессированы в 45-70% меланом.

Что касается mTOR (см. выше), то несмотря на то, что молекула TOR является неделимым производным двух её субъединиц, последние обладают совершенно разными полномочиями. Повреждение первого комплекса не несёт каких-либо катастрофических последствий для клетки, а нарушение TOR2 приведёт через несколько делений к так называемому «аресту» (прекращению) клеточного цикла на этапе фазы G2/M фазе . Если пострадают обе субъединицы, то клетка «замрёт» в фазе G0 в следующем поколении.

Следующим компонентом системы контроля клеточного цикла является система циклинзасимых киназ CDKN2A, CDK4 и CDK6. Мутации, делеции, гиперметилирование промотора являются нарушениями, обнаруживаемыми в 50% (CDKN2A) и 10-12% (CDK4) случаев меланомы, а наследуемые герминальные мутации в генах предрасположенности могут обусловливать возникновение семейной меланомы в 15% случаев.

CDKN2A (cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A) – ген, локализованный в коротком плече 9 хромосомы и кодирующий два белка, которые являются онкосупрессорами: р14 и р16. При помощи данных белков регулируется активность, пожалуй, самого известного онкосупрессора р53 и белка ретинобластомы (RB). В случае мутации CDKN2A (дупликация кодона R112) оба продукта данного гена подвергаются поломке. Мутации данного гена обнаружены в 30-40% случаев меланом, особенно часто они встречаются в контексте семейной меланомы. Спорадические соматические мутации CDKN2A встречаются в 50% случаев меланомы кожи, реализуемой либо путём деактивации р16, либо путём метилирования промотора (10%). Белковый комплекс циклина-D и CDK4 регулирует экспрессию RB, влияющего на активность клеточного цикла и пролиферацию клеток.

CDK4 (сyclin-dependent kinase 4) – фермент, кодируемый одноимённым геном и являющийся частью семьи циклинзависимых киназ. Будучи звеном единой системы контроля клеточного цикла, CDK4, как и CDK6, связан с соответствующими протеинами и белком ретинобластомы. В контексте канцерогенеза данные элементы выступают в роли рычагов управления клеточным циклом, неконтролируемая активность которого может быть результатом тех или иных нарушений в управляющих ферментах.

Ингибиторы циклинзависимых киназ блокируют активность соответствующих ферментов как самостоятельно, так в комплексе «фермент+циклин»; действуют данные препараты, как правило, в фазе G1 клеточного цикла.

В ядрах клеток меланомы наблюдается гиперэкспрессия фактора транскрипции NF-κB, который участвует в передаче сигнала как в МАРК-, так и в PI3K-сигнальных каскадах . В цитоплазме нормальных клеток, находящихся в стационарном состоянии, белок NF-κB не присутствует в свободном виде. Он связан с ингибиторным белком I-κB. Но при стрессовых воздействиях или поступлении внешних сигналов белок IκB фосфорилируется и высвобождает NF-κB, который перемещается в ядро и запускает транскрипцию более 100 генов, производящих белки, необходимые для реакции на стресс и выживания клетки.
Освободившийся ингибиторный белок IκB подвергается убиквитинированию и последующей деградации в протеосомах. В клетках меланомы нарушена протеасомная функция, и это приводит к пролиферации клеток меланомы и ингибированию про-апоптотических реакций при химиотерапии.

В выживании клеток меланомы также участвует противоапоптотический путь, опосредованный белком Bcl-2. Повышенная экспрессия Bcl-2 вовлечена в выживание меланомных клеток и инвазию опухоли. Преклинические исследования показали, что гиперэкспрессия Bcl-2 связана с повышенной продукцией сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и ангиогенезом. Избыточная экспрессия Bcl-2 может обуславливать резистентность к цитотоксической химиотерапии.