Очерк натуральной онкологии

[albert52]

Вставка.
Регуляция биосинтеза белка

Регуляция необходима для поддержания баланса разнообразных белков в клетке или организме, для изменения этого баланса в меняющихся условиях окружающей или внутриорганизменной среды, для обеспечения смены белков в процессах клеточной дифференцировки и развития организма, для адекватного ответа на специфические внешние сигналы или н***агоприятные воздействия.
Живые клетки используют несколько различных способов или путей такой регуляции, но практически во всех случаях она осуществляется через регуляцию инициации трансляции. Это означает, что регуляторные механизмы трансляции направлены на то, чтобы разрешить или не разрешить инициацию трансляции данной мРНК, и если разрешить, то с какой эффективностью (скоростью инициации): чем больше скорость, тем больше образуется белка.

Существуют три основных способа, как регулировать трансляцию. Первый способ – позитивная регуляция на основе сродства мРНК к инициирующей рибосоме и факторам инициации (дискриминация мРНК (англ. discriminate — отличать, распознавать)). Второй способ – негативная регуляция с помощью белков-репрессоров, которые, связываясь с мРНК, блокируют инициацию (трансляционная репрессия). При этом белок-репрессор имеет специфическое сродство к участку мРНК в районе инициации трансляции (часто к участку с нестабильной вторичной структурой) и, связываясь с ним (и стабилизируя его), создает барьер либо для посадки инициирующих рибосомных частиц, либо для движения рибосомы к месту инициации.

Этими двумя способами регулируются индивидуальные мРНК, то есть трансляция каждой мРНК может специфически контролироваться независимо от других мРНК клетки. Третий способ – тотальная регуляция трансляции всей совокупности мРНК клетки посредством модификации факторов инициации. Отметим что при наличии общих черт регуляции на уровне трансляции у прокариотических (бактерии) и эукариотических организмов тотальная регуляция за счет модификации факторов инициации характерна, по-видимому, только для эукариот.

Скорость или частота инициации трансляции рибосомами может сильно различаться для разных мРНК. У прокариотических организмов это определяется тем, что инициирующие или рибосомосвязывающие участки разных мРНК имеют разное сродство к рибосомам и, таким образом, с разной эффективностью связывают рибосомные частицы. На основании разницы в эффективности инициации можно говорить о «сильных» и «слабых» мРНК. На сильных мРНК инициация происходит часто, на них нанизывается много рибосом (образуются плотные полирибосомы) и соответственно продуцируется много молекул белка. Редкая инициация трансляции на слабых мРНК дает в результате редкую посадку рибосом на эти мРНК и, следовательно, низкую белковую продукцию.

Как правило, если белок имеет четвертичную структуру, построенную из разных субъединиц в различном соотношении, то сила мРНК или ее отдельных участков (цистронов), кодирующих эти субъединицы, координирована с пропорцией субъединиц в структуре. Например, мембранный комплекс протонной АТФазы бактерий построен из трех типов субъединиц в соотношении 1:2:10 (a1b2c10), и соответственно субъединица c кодируется очень сильным цистроном мРНК, субъединица a – слабым, а субъединица b – цистроном промежуточной силы.

Похожая ситуация наблюдается и в эукариотических клетках, но там дискриминация мРНК обусловлена скорее разным сродством факторов инициации, а не самих рибосом к разным 5'-проксимальным инициаторным структурам мРНК. Так как факторы инициации в любом случае локализуются на инициирующих малых рибосомных субчастицах, то они и определяют разную эффективность посадки рибосом на разные мРНК.
Различная сила мРНК в значительной мере определяет соотношение продукции различных белков в клетке. Так, структурные белки мембран, рибосомные белки, факторы элонгации, белки оболочки вирусов и другие белки, требуемые в большом количестве, например, пищеварительные ферменты, кодируются сильными мРНК, а многие регуляторные белки – слабыми мРНК.

Трансляция контролируется с помощью большого количества механизмов, наиболее понятным из которых является фосфорилирование факторов трансляции и их регуляторов, особенно ключевых факторов инициации трансляции эукариот (eIFs). mTORC1-опосредованное фосфорилирование eIF4E-связывающих белков (4E-BP) и рибосомных киназ S6 (S6Ks) приводит к устойчивой эффективности инициации трансляции (см выше).

eIF4F представляет собой гетеромерный комплекс, который связывает структуру кэпа и состоит из eIF4A (РНК-геликазы), eIF4E (связывающего кэп белка) и eIF4G (каркасный белок), который связывает как eIF4E, так и eIF4A. После связывания с кэпом eIF4F раскручивает 5'-проксимальную вторичную структуру мРНК, чтобы облегчить связывание преинициативного комплекса 43S (который включает 40S рибосомную субъединицу). После сканирования вдоль 5'-UTR на предмет подходящего стартового кодона AUG, комплекс предварительной инициации затем растворяется, и рибосомная субъединица 60S присоединяется к субъединице 40S с образованием трансляционно компетентной 80S рибосомы.

Этому процессу способствует фактор eIF5B (5B), который инициирует удлинение трансляции. Фаза элонгации характеризуется добавлением аминокислот к растущему пептиду и транслокацией рибосом по мРНК, процессом, который частично контролируется фактором элонгации eEF2. Наконец, прекращение трансляции связано с высвобождением вновь синтезированного пептида и диссоциацией рибосомы от мРНК.

Для связывания инициаторной аминоацил-тРНК (Met-tRNAi) с малой рибосомной субчастицей в процессе инициации трансляции требуется eIF2 в комплексе с ГТФ (GTP); в ходе инициации ГТФ гидролизуется на ГДФ (GDP) и ортофосфат и eIF2 в комплексе с ГДФ (eIF2 : GDP) освобождается из рибосомы.
В норме дополнительный фактор eIF2В принимает участие в том, чтобы превратить отработанный (неактивный) eIF2 : GDP в необходимый для следующей инициации eIF2 : GTP. Этот фактор играет каталитическую роль в обмене ГДФ на ГТФ, и его в клетке мало. Когда eIF2 фосфорилируется фосфокиназой (eIF2Р), он может обычным образом участвовать в инициации трансляции, но, освободившись из рибосомы с ГДФ (в форме eIF2Р : GDP), он образует прочный комплекс с eIF2В (eIF2В : eIF2Р : GDP) и тем самым связывает весь eIF2В клетки, лишая последнюю возможности катализировать регенерацию eIF2 : GTP из eIF2 : GDP, тем самым подавляя синтез белка.

Механизмы трансляционной репрессии обеспечивают пути модуляции скоростей инициации трансляции в широких пределах либо в зависимости от внешних сигналов (эффекторов), либо по типу обратной связи, когда мРНК репрессируется своим же продуктом. Что же касается эффекторов, то, например, в животных клетках белок-репрессор блокирует инициацию синтеза белка ферритина, а железо в качестве эффектора лишает репрессор его мРНК-связывающих свойств и дерепрессирует ферритиновую мРНК, тем самым разрешая ее трансляцию.

Кроме типичной трансляционной репрессии эукариоты выработали механизм маскирования мРНК, когда соответствующая мРНК становится недоступной не только для инициации трансляции, но и фактически выведена из всех других процессов ее возможных превращений или изменений – деградации нуклеазами, ферментативной модификации ее 3'-конца путем полиаденилирования и пр.
Маскирование и демаскирование мРНК являются особенно характерными для процессов гаметогенеза (оогенеза и сперматогенеза), раннего эмбрионального развития, клеточной дифференцировки, гормонального включения или выключения функций. Например, в оогенезе происходит запасание некоторых материнских мРНК в маскированной форме, и часть этих мРНК демаскируется в ответ на оплодотворение яйцеклетки, обеспечивая белковый синтез на самых ранних стадиях эмбриогенеза: дробления, бластулы и ранней гаструлы.

Наиболее обычный путь тотальной регуляции белкового синтеза у эукариот, во всяком случае у животных и грибов, – это активация специальной фосфокиназы (eIF2Р), которая фосфорилирует фактор инициации eIF2, что приводит к подавлению инициации трансляции всех мРНК клетки (см. выше). Сигналами для активации фосфокиназы в клетке являются тепловой шок и другие виды стрессовых воздействий, недостаток ростовых факторов, аминокислотное голодание, недостаток железа, вирусные инфекции. Степень подавления белкового синтеза может варьировать в зависимости от уровня стресса.

Для многих локализующихся мРНК репрессия трансляции отменяется сразу после прибытия в конечный субклеточный пункт назначения. Субклеточное положение белка является ключевым фактором, определяющим его функцию. Локализующиеся мРНК упакованы в рибонуклеопротеидные комплексы (комплексы RNP), которые взаимодействуют с моторами цитоскелета для направленного транспорта по дорожкам цитоскелета, что является эволюционно консервативным механизмом для контроля локализации белка. При этом мРНК совместно собираются в мультимолекулярные транспортные единицы. Различные регуляторы трансляции, которые обнаруживаются в комплексах RNP, представляют собой челночные белки, которые содержат сигналы ядерной локализации и накапливаются, по крайней мере, временно в ядре.
Транспортные RNP могут иметь общие компоненты с процессинговыми тельцами (P-тельцами) - общими цитоплазматическими сайтами для подавления трансляции.

Локализованные мРНК впоследствии транслируются в ответ на локализованные сигналы. Синтез на месте придает белку новые сигнальные свойства и помогает поддерживать локальный протеомный гомеостаз.
Локализация РНК может быть эволюционно консервативным механизмом, который децентрализует геномную информацию и делегирует ее контроль субклеточным компартментам. Генетическая информация, закодированная в ядре, обеспечивает поставку мРНК путем транскрипции, из которой выбираются определенные наборы мРНК для субклеточной локализации. Т.о. субклеточные целевые коллекции мРНК могут функционировать как геномный форпост.

[albert52]

Вставка

Стрессовые гранулы

Стрессовые гранулы (SG) представляют собой разделенные по фазам биомолекулярные конденсаты РНК-связывающих белков (RBP) и мРНК, которые образуют жидкие каплеобразные безмембранные цитоплазматические компартменты в ответ на стресс. Основная функция SG заключается в том, чтобы способствовать выживанию клеток в условиях стресса, обеспечивая временный резервуар для хранения остановившихся в трансляции мРНК, RBP и рибосомных белков. Эукариотические клетки отключают некоторые клеточные трансляции в ответ на стрессы в окружающей среде (обычные стрессы в окружающей среде - гиперосмолярность, тепло и окислительные условия), чтобы сэкономить энергию и ответить на повреждение, вызванное стрессом.
Домен низкой сложности, содержащийся во многих RBP, связанных с SG, имеет тенденцию быть внутренне неупорядоченным и служит движущей силой для разделения липид-липидной фазы (LLPS), которое инициирует сборку SG.

В нормальных клетках после снятия стресса динамические SG быстро разбираются молекулярными шаперонами, UPS и VCP (UPS, убиквитин-протеасомная система; VCP, валозинсодержащий белок), тогда как аберрантные SG и твердые белковые агрегаты очищаются путем аутофагии. Дело в том, что при болезненных состояниях может происходить аберрантная сборка SG и/или фазовый переход из жидкости в твердую, вызывая образование твердых белковых агрегатов, которые считаются патогенными . Показано, что вызывающие заболевание мутации в генах, кодирующих SG-ассоциированные RBP, изменяют свойства белков, делая их менее растворимыми и склонными к агрегации. Кроме того, неправильное сворачивание белков увеличивается при клеточном стрессе и нарушении протеостаза. Неправильно свернутые белки, по-видимому, накапливаются в SG, что приводит к тому, что последние теряют жидкоподобную динамику и образуют агрегацию белков.

Белковый гомеостаз (протеостаз) относится к сбалансированному состоянию, в котором белки поддерживаются в правильной конформации, концентрации и внутриклеточном расположении, чтобы они могли выполнять свои клеточные функции для поддержания целостности и функциональности клетки. Для регуляции протеостаза в клетках развилась сложная система, которая контролирует весь жизненный цикл белков от синтеза до утилизации. Система регуляции протеостаза включает множество компонентов, в том числе механизм трансляции, молекулярные шапероны и ко-шапероны, убиквитин-протеасомную систему (UPS) и путь аутофагии.

Молекулярные шапероны представляют собой класс белков, которые способствуют сворачиванию и повторной укладке белков, а также сборке белковых комплексов. Белки теплового шока (Hsps), вероятно, являются наиболее широко изученными шаперонами, которые делятся на подсемейства в зависимости от их молекулярной массы, включая Hsp90, Hsp70, Hsp40 и малые Hsps. Hsps играют жизненно важную роль в рефолдинге, деградации и секвестрации неправильно свернутых белков либо АТФаз-зависимым, либо АТФаз-независимым образом, а также регулируют разборку и клиренс SG.

Убиквитинирование белков, по-видимому, является молекулярным сигналом, используемым как для деградации белков с неправильной укладкой, так и для оборота аберрантных SG. VCP извлекает РНК-связывающий белок G3BP1 из SG и запускает разборку SG; G3BP является ядром сети взаимодействия в SG. При тепловом шоке G3BP1 в SG подвергается массовому убиквитинированию; белок, ассоциированный с ER, FAF2 распознает убиквитинированный G3BP1 и доставляет его в VCP. «Извлечение» G3BP1 из SG с помощью VCP запускает диссоциацию других белков SG, что приводит к разборке SG.

У млекопитающих семейство белков G3BP состоит из трех гомологичных белков; G3BP1 (основной вариант), G3BP2a и его вариант сплайсинга G3BP2b; общая структура белка создает трехмерную платформу, которая связывает РНК. Отметим, что статус фосфорилирования G3BP1 может функционировать как переключатель роста клеток, где фосфорилированный G3BP1 путем связывания с 3'-UTR опосредует деградацию мРНК белков роста, и, таким образом, уменьшает клеточную пролиферацию. В целом статус фосфорилирования G3BP может влиять на судьбу мРНК, защищая их от деградации во время клеточного стресса, доставляя в SG. Кстати в пролиферирующих клетках G3BP1 гипофосфорилируется, теряя способность расщеплять мРНК.
3'-нетранслируемые области ( 3'-UTR ) матричных РНК (мРНК) регулируют процессы, основанные на мРНК, такие как локализация и стабильность мРНК, и трансляция. Именно к ним присоединяются RBP (см. выше), определяя посттрансляционные модификации. В целом 3'-UTR действуют как каркасы для регуляции локализации мембранных белков.

Хотя G3BP экспрессируются во всех нормальных клетках, некоторая специфическая экспрессия изоформ в тканях была идентифицирована для G3BP1 в легких и почках, для G3BP2a в мозге и для G3BP2b в тонкой кишке. G3BPs представляют собой главным образом цитоплазматические белки, но различие в распределении было зарегистрировано для различных изоформ: G3BP1 может локализоваться в ядрах в покоящихся клетках, наиболее вероятно из-за фосфорилирования в Ser149.

Раковые клетки требуют экспресии G3BPs, которые служат вспомогательными генами, способствующими их выживанию . Отметим, что G3BP являются важными составляющими вирусных фракций CHIKV и HCV, облегчая репликацию и сборку вирусов. Кстати, PTEN может модулировать уровни экспрессии нескольких белков, негативно регулируя уровни экспрессии белка G3BP1 и AKAP121.

Сверхэкспрессия G3BP1 опосредует EMT в клетках рака молочной железы через сигнальный путь Smad; нокдаун G3BP1 блокировал мезенхимный фенотип клеток. G3BP2 играет роль в инициации рака молочной железы путем стабилизации транскриптов мРНК онкогена SART3(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3), отвечающего за экспрессию плюрипотентных факторов транскрипции Oct-4 и Nanog. G3BP2 может служить позитивным регулятором инициации рака молочной железы, а также негативным регулятором метастазирования рака, так как G3BP2 нужен для приобретения свойств, инициирующих рак, а при метастатической колонизации раковые клетки должны потерять свой EMT-фенотип.
Кроме того, G3BP1 сверхэкспрессируется при гепатоцеллюлярной карциноме (HCC) и участвует в EMT из HCC, стимулируя экспрессию Slug, члена семейства транскрипционных факторов цинкового пальца SNAIL, которые индуцируют EMT. При раке поджелудочной железы межклеточное вещество уплотняется (жесткая матрица), TWIST1 отсоединяется от G3BP2 и движется к ядру, что приводит к индукции EMT.

[albert52]

Продолжим.

Сборка стрессовых гранул (SGs) и процессинговых Р-телец является хорошо известной клеточной стратегией для уменьшения повреждений, связанных со стрессом, и обеспечения выживания клеток. Остановка процесса трансляции из-за стресса создает обширный репозиторий компонентов SG, таких как факторы инициации трансляции, РНК- и не-РНК-связывающие белки и мРНК (см. выше). С снятием стресса и прекраще -нием ингибирования трансляции SG разбираются, и мРНК направляется к транслирующимся полисомам, а P-тела рекрутируют мРНК для возможной деградации.

Основной белковый компонент SG, состоящий из РНК-связывающих белков, также может иметь два специфических домена: прионоподобные богатые глицином домены низкой сложности (PLD) и внутренне неупорядоченные домены (IDD), которые могут образовывать белковые агрегаты. Перегруженные РНК белки (особенно белки с доменами IDD и PLD), диспергированные в цитоплазме или нуклеоплазме (растворимая фаза), сливаются в концентрированное состояние с образованием SG; при этом происходит разделение фаз жидкость-жидкость (конденсированная фаза).

В то время как многие острые стрессы способствуют конденсации SG через фосфорилирование eIF2α, было показано, что хронические стрессы преодолевают фосфорилирование eIF2α, что в конечном итоге снижает образование SG. При этом мРНК может идти тремя путями: оставаться в структуре SG и запасаться, возобновлять трансляцию или двигаться в сторону деградации.
С другой стороны, хронический стресс в некоторых случаях может способствовать увеличению фосфорилирования eIF2α, например, во время эпителиально-мезенхимального перехода и при нейродегенеративных заболеваниях; oжидается, что эти условия способствуют сборке SG. Фосфорилирование eIF2α, аналогично его роли в контексте острых стрессов, важно для индукции образования SG в условиях хронической нехватки питательных веществ; вероятно, это происходит посредством активации GCN2 (general control nonderepressible 2) вследствие накопления незагруженных транспортных РНК (тРНК), которые связываются с GCN2, что приводит к конформационным изменениям и активации киназы.

Отметим, что гомеостатическая интегрированная реакция на стресс (ISR) представляет собой эволюционно консервативный гомеостатический процесс, который позволяет клеткам млекопитающих ощущать, адаптироваться и соответствующим образом реагировать на широкий спектр внеклеточных и внутриклеточных сигналов стресса. Четыре различных эукариотических киназы фактора инициации 2 (eIF2), включая GCN2, РНК-зависимую протеинкиназу (PERK), протеинкиназу R (PKR) и гем-регулируемую киназу eIF2α (HRI), опосредуют ISR. GCN2 ощущает недостаток аминокислот, PERK активируется стрессом эндоплазматического ретикулума, PKR ощущает вирусную двухцепочечную РНК (dsRNA), а HRI ощущает депривацию гема. Кстати, большинство химиотерапевтических препаратов обычно стимулируют накопление SG, активируя эти фосфорилирующие киназы.

Белок-белковые и РНК-РНК-взаимодействия, которые удерживают вместе хронические SG, вероятно, аналогичны тем, которые были описаны для острого SG. Как и в случае острых стрессов, истощение G3BP1 и G3BP2 полностью нарушает конденсацию SG; при этом при хроническом алиментарном голодании истощение SG приводит к улучшению выживаемости. Дело в том, что внутри стрессовых гранул происходит частичная секвестрация рецепторов активированной С-киназы-1 (RACK1), что снижает активацию каспазы-3, то есть если образование SG блокируется во время стресса, выживаемость клеток значительно снижается. Однако SG, индуцированные патологическим хроническим стрессом (нейродегенерация, голодание по питательным веществам), лишены нескольких классических компонентов SG, которые вносят вклад в выживательные функции канонических SG (RACK1, малые рибосомальные белки) и, наоборот, имеют функцию про-апоптоза.

Образование SG, по-видимому, регулирует несколько канонических сигнальных путей (NF-κB, mTORC1, PKR, RIGI) в ответ на стресс. Так, SGs перехватывают и изолируют компоненты передачи сигналов, такие как RACK1 (передача сигналов p38/JNK), TRAF2 (передача сигналов NF-kB), Raptor (передача сигналов mTOR) и RhoA/ROCK1 (передача сигналов Wnt). Аутофагия частично отвечает за клиренс SG, предполагая, что благоприятные эффекты препаратов, индуцирующих аутофагию, могут быть частично связаны с усилением клиренса SG во время лечения.

SG и онкогенез

Рак можно обсуждать с трех разных точек зрения: формирование рака и онкогенез, выживание рака и метастазирование, инвазия и прогрессирование раковых клеток. Опухолевые клетки часто подвергаются хроническому стрессу, и помимо влияния на клеточную пролиферацию, проонкогенные гиперактивные сигнальные пути усиливают образование SG, что продлевает жизнь раковых клеток. Истощение SG приводит к улучшению выживаемости больных.

При раке от двадцати до тридцати процентов всех раковых заболеваний человека имеют изменения RAS (KRAS-HRAS-NRAS). KRAS часто встречается при аденокарциноме поджелудочной железы и колоректальном раке, NRAS — при меланоме, раке щитовидной железы и лейкемии. Мутантный белок RAS вооружает клетку против стрессов, связанных с опухолью; так, мутанты KRAS индуцируют образование SG путем повышающей регуляции 15d-PGJ2 (15-дезокси-дельта-простагландина J (2)) посредством нижестоящих эффекторных молекул, RALGDS и RAF, а также увеличения экспрессии циклооксигеназы-2 (COX-2).
15d-PGJ2 нацелен на цистин 264 в eIF4A, нарушая его взаимодействие с eIF4G, необходимое для процесса трансляции. Кстати, сорафениб, противораковый препарат, который попутно увеличивает продукцию SG по пути GCN2/eIF2a, сильно зависит от экспрессии COX-2, секвестированного в SG, и ингибирование COX-2 целекоксибом приводит к усилению ответа на лечение сорафенибом.

В пути pi3k/Akt mTORC1 ингибирует действие 4E-BP на eIF4E путем фосфорилирования и инактивации eIF4E-BP во время киназного каскада PI3K-mTOR, образуя комплекс eIF4F, который отвечает за идентификацию кэп-структуры на 5'-конце мРНК, инициируя, таким образом, трансляцию. Ингибируя mTORC1 при стрессе, eIF4E-BP остается активным и ингибирует образование комплекса eIF4F, останавливая процесс трансляции на начальной стадии. Этот процесс предрасполагает к формированию SG, оставляя PIC (преинициаторный комплекс) на мРНК, что действует как гнездо для SG.

Таким образом mTOR является одним из наиболее важных путей образования SG; ингибирование mTORC1 торкинибом может привести к нарушению образования SG или истощению eIF4G1 или eIF4E, что может нейтрализовать связанный с SG антиапоптотический путь p21. Также Grb7 (адаптерный белок 7, связанный с рецептором фактора роста) фосфорилирует условиях стресса тирозинкиназу Syk по остатку тирозина, вызывая образование SG, и сам рекрутируется в структуру SG. Когда стресс снимается, это рекрутирование способствует образованию аутофагосом и клиренсу SG в клетке, повышая способность клеток противостоять стрессовому стимулу.

В целом влияние SG на пролиферацию идет по двум путям — влияние на клеточный цикл и факторы, регулирующие пролиферацию, и влияние на транскрипты этих факторов. SG играют важную роль в поддержании клеток в развитии клеточного цикла и предотвращении вступления клеток в фазы клеточной гибели.
SP1 представляет собой транскрипционный фактор, играющий важную роль в регуляции SG-нуклеирующих белков, таких как HuR, TIA1/TIAR и G3BP1; истощение клеток по SP1 приводит к гибели клеток. HuR и CIRP совместно локализованы в SG, и CIRP играет ключевую роль в положительной регуляции HUR, а HuR повышает уровень циклина-Е1 в раковых клетках. Сверхэкспрессия циклина E1 увеличивает долю клеток в S-фазе, что приводит к усилению фосфорилирования Rb и клеточной пролиферации во многих моделях линий раковых клеток.

Отметим что регуляция сборки или разборки SG может быть ключевым методом контроля судьбы клеток или лечения заболеваний. Следовательно, это многообещающая область для разработки потенциальных терапевтических стратегий путем нацеливания на белки SG. Как пример рекрутирование мРНК в цитоплазме для слияния со зрелыми SG требует транспортировки по микротрубочкам моторными белками; таким образом, целостность микротрубочек важна для сборки SG. Микротрубочки представляют собой внутриклеточные структуры, собранные из гетеродимеров α- и β-тубулина и отвечающие за различного рода движения в клетках.
Деполимеризующие тубулин агенты могут вызвать исчезновение SG. Как обратимый ингибитор микротрубочек, нокодазол связывается с β-тубулином и нарушает кинетику сборки и разборки микротрубочек, тем самым предотвращая митоз и индуцируя апоптоз в опухолевых клетках. Нокодазол ингибирует образование SG, но не предотвращает фосфорилирование eIF2α, указывая на то, что он действует после фосфорилирования eIF2α.
Винбластин также вызывает деполимеризацию микротрубочек и, подобно нокодазолу, нарушает образование SG и разборку образовавшихся SG. Однако более высокая концентрация или длительное лечение винбластином сильно способствует репрессии трансляции и индуцирует микроскопические SG.

[albert52]

Вернемся к сигнальным путям.

На большинство поступающих в клетку сигналов она реагирует не напрямую: между поступающим раздражителем и специфической реакцией клетки лежит целый внутриклеточный каскад сигнальных молекул, представляющих собой путь биохимических превращений. Задача таких биохимических путей — усилить или ослабить передаваемый клетке сигнал и перевести его в такую форму, чтобы позволить реализоваться ответным реакциям.
Комплексная взаимоорганизация всех задействованных в сигнальных путях белков формирует сеть внутриклеточной передачи сигналов, которая похожа на множество сотен сходящихся и вновь разветвляющихся, пересекающихся путей, переключающихся на различных белках, которые условно напоминают станции для пересадок в метро. B ней можно выделить несколько путей, которые в клетках большого количества опухолей дефектны и обнаруживают отклонения от нормы.

Mногие сигнальные пути довольно сложно различать как функционально, так и биохимически, и между многими из них зачастую существуют прямые активирующие и/или угнетающие связи. Примером тому может служить сеть p53/Rb, объединяющая важные сигнальные пути, которые регулируют процессы клеточного деления, апоптоза и репарации ДНК.
Рецепторы, с которых начинается путь МАРК, относятся к рецепторным тирозинкиназам (receptor tyrosine kinases, RTK). Многие гены рецепторных тирозинкиназ являются гомологами вирусных онкогенов. В зависимости от подтипа рецептора и задействованного адапторного белка активируются те или иные пути.
По структурным характеристикам внеклеточных доменов RTK можно разделить на несколько классов. К примеру, представители семейств PDGFR (рецептор тромбоцитарного фактора роста), FGFR (рецептор фактора роста фибробластов), VEGFR-1/-2 (рецептора фактора роста эндотелия сосудов) обладают соответственно пятью, тремя и семью Ig-подобными доменами. Однако несмотря на многообразие классов рецепторных тирозинкиназ, механизм их активации практически одинаков.

Согласно этой модели, в несвязанном состоянии между активными димерами и неактивными мономерами рецептора постоянно поддерживается равновесие. Присоединение лиганда ведёт к димеризации и смещает равновесие в сторону образования активной формы рецептора. Образование активных димеров может быть инициировано напрямую лигандами, связывающимися сразу с двумя мономерами, как, например, EGF (epidermalgrowth factor) способствует димеризации своего рецептора Egfr. Также связывание с лигандом может вызывать изменение конформации внеклеточного домена, что ведет к экспозиции сайтов связывания, как например, SCF (stem cell factor) вызывает димеризацию Kit-рецепторов.
Итогом процесса димеризации является сближение внутриклеточных доменов друг с другом, вследствие чего наступает преходящая активация внутренней тирозинкиназной активности каталитических доменов, что приводит к трансфосфорилированию специфических остатков тирозина цитоплазматического домена. С фосфорилированным рецептором могут связываться белки с SH2-доменами. Комплекс связанного с таким белком рецептора может опосредовать активацию, например, какого-либо фермента или изменение реакционной способности белка.
В отсутствие лигандов RTK представляют собой мономерные полипептидные цепочки (исключение — семейство рецепторов инсулина, которые состоят из 4 пептидных цепей, соединённых дисульфидными мостиками).

Активация RTK, предваряющая развитие событий внутри клетки, приводит к связыванию SH2-домена адапторного белка — GRB2 (Growth Factor Receptor bound 2) — на фосфорилированном остатке тирозина активированной RTK. Помимо SH2-домена, GRB2 содержит также два SH3-домена, имеющих сродство к взаимодействию с богатыми пролином участками белка, который гомологичен белку плодовой мушки Drosophila — SOS (son of sevenless) — и потому у млекопитающих данный белок также имеет название SOS. Этот белок является фактором обмена гуаниновых нуклеотидов и опосредованно (с помощью одного из Ras-белков: HRas, KRas, NRas) катализирует обмен ГДФ на ГТФ.
В ГТФ-связанной форме белки Ras способны активировать и другие протеины. Среди важнейших эффекторов Ras можно выделить фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), фактор обмена Ral (RalGEF) и фосфолипазу С (PLC).
Самым известным эффектором Ras является серин-/треонинкиназа B-Raf, которая ведет к запуску классического пути МАРК. Решающим моментом для активации В-Raf-киназы является не связывание на Ras-GTP, а перемещение на внутреннюю поверхность плазматической мембраны. Для завершения активирования белок должен быть также фосфорилирован, за что, вероятно, отвечает Src-киназа.

MAPK-каскад – ключевой в выживании и диссеминации опухолевых клеток, а также в их лекарственной устойчивости. Здесь сходятся сигналы от различных раздражителей, будь то внутренние “происшествия“ (метаболический стресс, повреждения ДНК и изменения концентраций белков) или связь с другими клетками, взаимодействия клетка-матрикс, сигналы от внешних факторов роста. Мутация генов, ответственных за регуляцию клеточной судьбы, целостность генома и выживание клеток, может привести к усилению амплификации белков и изменить микроокружение опухоли, тем самым вызвав чрезмерную активацию пути.
Понимание разной природы активации MAPK/ERK-пути для каждого вида опухоли – критически важный момент в создании монорежимов и комбинаций препаратов, так как разным опухолям присущи свои уникальные механизмы первичного и вторичного сигналинга и, как следствие, чувствительности к препаратам.

Эти мутации могут случиться как на вершине каскада, в генах мембранных рецепторов, например, EGFR, преобразователях сигналов (белков RAS), регуляторов (белков Sprouty), так и в киназах, расположенных ниже и принадлежащих собственно пути MAPK/ERK (BRAF). Некоторые из этих мутаций уже установлены и являются целью терапии. Действие препаратов основано на изменении и регуляции опухолевого сигналинга в этой сложной сети и зависящих от неё путях.

Всего существует 4 независимых каскада MAPK, состоящих из 4 сигнальных семейств: семейство MAPK/ERK, или классический путь, и 3 других семейства (Big MAP kinase-1 (BMK-1), c-Jun терминальной киназы и белка p38). Основная структура у этих семейств общая: 2 серин/треониновые киназы и 1 треонин/тирозиновая киназа двойной специфичности (она может фосфорилировать и треониновые, и тирозиновые остатки). В порядке генерацией сверху вниз, по направлению к ядру, эти киназы обозначены как киназа киназы MAPK (MAPKKK), киназа MAPK (MAPKK) и, собственно, MAPK. Традиционный путь MAPK/ERK состоит из 3 типов MAPKKK: киназы A-RAF, B-RAF и RAF-1 или C-RAF. На этом уровне в человеческих опухолях чаще всего мутирует ген BRAF. Уровнем ниже находятся MAPKK, их 2: MEK1 и MEK2. В самом низу каскада находятся конечные эффекторы пути MAPK – белки ERK1 и ERK2 (см. выше).

Фосфорилирование ERK приводит к активации нескольких субстратов, ответственных за стимуляцию размножения клеток. От местонахождения ERK зависит субстрат-цель и дальнейшие эффекты. Цитоплазменная ERK фосфорилирует белки цитоскелета, обеспечивая движения клетки, её метаболизм и адгезию и участвуя в регуляции других сигнальных путей. К цитоплазматическим субстратам относятся рибосомальные S6 киназы (RSK), которые регулируют киназу-3 гликогенсинтазы (участвует в метаболизме), и молекулы адгезии L1, блок неврального происхождения (участвует в клеточной адгезии). Сразу после активации MAPK/ERK ER киназа отделяется от цитоплазматических якорных белков и может переместиться в ядро (см. выше), где участвует в регуляции транскрипции.
Активная ERK в ядре фосфорилирует и активирует различные факторы транскрипции, например, карбамоилфосфатинтетазу II (CPS II), связанную с синтезом ДНК или p90RSK и поддерживающую ход клеточного цикла.

Кроме пространственной локализации конечные эффекты пути MAPK/ERK зависят ещё и от времени, длительности и интенсивности его сигнала. Восприятие и ответ клеток разнятся и зависят даже от небольших изменений в уровне активации MAPK/ERK. Специфические белки, например, супрессор киназы Ras-1, работают как главный каркас, основа для участвующих в активации каскада MAPK/ERK белков. Цитоплазматические белки, Sprouty и Spred, напрямую подавляют сигнальный путь, отсоединяя от ERK активирующие фосфатные группы, тем самым лишая ERK возможности фосфорилировать свои субстраты-мишени.

Сложность каскада MAPK – не случайность и не забавная шутка природы; она делает возможной периодическую внешнюю адаптацию, необходимую для активации и регуляции критических для выживания клетки событий. Активация MAPK/ERK и последующие взаимодействия – чётко регулируемые процессы, и в опухолевых клетках контроль над ними потерян.

[albert52]

Продолжим.

Стимуляция рецепторов факторов роста в клеточной мембране запускает 2 основных сигнальных пути, разных, но связанных между собой: сигнал фосфоинозитид-3-киназы(PI3K) активирует белок AKT, следовательно, его субстраты, и каскад MAPK/ERK. Оба этих пути управляют пролиферацией, выживанием и диссеминацией клеток. Каскад PI3K/AKT также поддерживает анаболизм, тогда как MAPK/ERK более активен в пролиферации и инвазии. Усиление сигналинга MAPK/ERK – результат гиперэкспрессии или неправильной активации рецепторов тирозинкиназ (RTK) или их прямых мишеней (PI3K, SRC и RAS). Нормальная работа MAPK/ERK также отвечает за подавление онкогенеза путём запуска механизмов старения и убиквитинизации. Старение включает в себя подавление пролиферации клеток с помощью терминального ареста клеточного цикла.

Генетические мутации могут разбалансировать активность киназ и гиперактивировать каскад MAPK во время запуска и развития онкогенеза. Онкогенных драйверных мутаций в MAPK/ERK установлено довольно много, и они различны для разных типов опухолей. Это могут быть и мутации 21 экзона в EGFR, и мутации KRAS, и классическая мутация V600EBRAF. В общем и целом мутации, затрагивающие MAPK/ERK, — события одиночные и независимые. Так, две трети карцином щитовидной железы несут активирующие мутации или в гене рецепторной тирозинкиназы RET, или KRAS, или BRAF1. И только в очень небольшом проценте опухолей были обнаружены мутации в двух различных генах сигнального пути.

Ингибиторы RAF могут запустить ненормальную пролиферацию клеток кожи и привести к возникновению кератоакантом или плоскоклеточного рака кожи приблизительно у 10-20% пациентов. Виной этому является парадоксальная активация каскада MAPK/ERK в нормальных кератиноцитах. Комбинация ингибиторов BRAF и MEK при метастатической меланоме повысила безопасность лечения, сбалансировав активацию нормального MAPK/ERK, и значительно снизила частоту парадоксальных онкогенных изменений кожи. В целом использовать генные мишени в своих целях следует с учётом уникальных черт, присущих человеческим опухолям.

Белки Ras закреплены на клеточной мембране с внутренней стороны посредством жирной кислоты, ковалентно связанной с карбокситерминальным концом белка, и это семейство белков можно сравнить с молекулярным переключателем МАРК. Обмен ГДФ на ГТФ и сопряжённый с этим переход неактивной формы Ras в активную катализируется SOS (SOS1, SOS2) — ферментом, относящимся к группе факторов обмена GEF (Guanine Exchange Factors).
Активная форма Ras может проявлять собственную невысокую ГТФ-азную активность и гидролизовать связанный ГТФ до ГДФ, тем самым самоинактивируясь. Этот процесс довольно длителен, хотя и облегчает обмен на GTP, который присутствует в гораздо более высоких концентрациях в цитозоле, но он многократно ускоряется ГТФ-аза-активирующими белками (GAP), например, p120GAP (p120 GTPase activating Protein) и нейрофибромином (NF1GAP). Мутации в генах онкопротеинов Ras ведут к предотвращению реакции гидролиза, вследствие чего сигнальный путь длительное время остаётся активным.

Наряду с Ras существуют и другие ГТФ-связывающие белки, которые с помощью подобных биохимических механизмов активируются или инактивируются и имеют различные задачи. Малые ГТФазы имеют примерно половину размера α-субъединицы гетеротримерных G-белков и среди них хотелось бы упомянуть семейство Rho, представители которого играют ключевую регуляторную роль в сигнальной передаче от цитокиновых рецепторов, а также в организации актинового цитоскелета клетки и микротрубочек. Rho GTPases составляют подсемейство малых GTPases, которое также включает подсемейства Ras, Ran, Rab и Sar1/Arf. Rho GTPases контролируют множество клеточных функций посредством регуляции сократительной способности актина и периферических актиновых структур, включая морфологию клеток, локомоцию и полярность.
Активные Rho ГТФ-азы располагаются на клеточной мембране, где, связывая специфические эффекторные белки, они обеспечивают последующую трансдукцию сигнала, вызывая перестройку цитоскелета. Находясь в неактивной конформации, Rho GTPases связываются с ингибиторами диссоциации гуаниновых нуклеотидов (GDI), что способствует их стабилизации и предотвращает их активацию.

Семейство малых G-белков Rho (~21 кДа) включает 20 членов, классифицированных как Rac (Rac1, Rac2, Rac3 и RhoG), Rho (RhoA, RhoB и RhoC) и Cdc42 (Cdc42, TC10, Chip, TCL, и Wrch-1) и другие менее изученные ГТФазы, включающие RhoD, RhoE и RhoH. Rho благоприятствует ранним стадиям онкогенеза, однако RhoB может ограничивать развитие высокоагрессивных опухолей; потеря RhoA скорее ускоряет образование аденом легких.

Rac участвуют в образовании активных форм кислорода (АФК) посредством активации никотинамидадениндинуклеотидфосфатных (НАДФН) оксидаз NOX1 и NOX2. Rho регулирует образование стрессовых волокон и сокращение клеток, тогда как Rac и Cdc42 регулируют образование ламеллоподий и филоподий соответственно, и стимулируют протрузивную деятельность (динамические события в передней части движущихся клеток, обеспечивающие их продвижение).
Убиквитинирование лигазами FBXL19 и HACE1 E3 влияет на уровни экспрессии Rac. В соответствии с ролью Rac в контроле комплексов НАДФН-оксидазы, дефицит супрессора опухоли HACE1 увеличивает выработку активных форм кислорода (АФК), что, в свою очередь, приводит к зависимости от Gln, основного источника питательных веществ для опухолевых клеток. Более того, подавление HACE1 взаимодействует со сверхэкспрессией ErbB2/HER2 в клетках молочной железы, вызывая гиперактивацию Rac1, миграцию, злокачественную трансформацию и онкогенез in vivo.

Семейство Pak расположенно ниже как Rac, так и Cdc42 и являются критическими эффекторами, которые связывают семейство Rho GTPases (Rho GTPases) с реорганизацией цитоскелета и ядерной передачей сигналов. p21-активируемые киназы (PAK) представляют собой Ser/Thr киназы, которые на основании их структурных и функциональных особенностей подразделяются на две группы: группу I (PAK1–3) и группу II (PAK4–6). PAK группы I имеют аутоингибирующий домен (также называемый ингибирующим доменом-переключателем) и киназный домен (каталитический домен, CD) и активируются за счет связывания активных (то есть связанных с GTP) форм Rho GTPases, таких как как Cdc42 и Rac1. PAK группы II не имеют автоингибирующих доменов и не активируются активными Rho GTPases.

Тот факт, что на сегодняшний день идентифицировано около 80-ти типов GEF и 70-ти — GAP, что количественно превосходит Rho ГТФ-азы, коих имеется около 20-ти, может говорить о необходимости строгого контроля регуляции локальной активности Rho, чтобы предотвратить ошибочную передачу исходного сигнала. В опухолевых клетках активность Rho ГТФ-аз ненормально высока, что может быть обусловлено изменённой генной экспрессией или нарушенной функцией регуляторов, в меньшей степени — активирующими мутациями в самих Rho ГТФ-азах.

Множественность клеточных исходов, регулируемых более чем 70 идентифицированными Rho GEF, диктуется их дифференциальным паттерном экспрессии и селективностью в отношении белков Rho, а также сложными механизмами, регулирующими их активацию. Среди многих GEF семейства Rho, регулирующих активность Rac и участвующих в прогрессировании рака, члены семейства Ect2, Tiam1, P-Rex и Vav являются наиболее заметными, связанными с онкогенезом и метастазированием. Например, избыточная экспрессия Vav3 при раке яичников связана с плохим прогнозом и придает резистентность к установленным терапевтическим режимам.
P-Rex1 демонстрирует значительную базальную ассоциацию с плазматической мембраной; сходным образом значительное количество PI 3-kinase-γ связано с мембраной даже в отсутствие стимуляции. Эта базовая ассоциация PI 3-киназы- γ и P-Rex1 с плазматической мембраной может быть необходима для чрезвычайно быстрой активации Rac. Кстати, эти молекулы могут быть аллостерически активированы с помощью скаффолдов.
Повышенный ядерный Rac1 в опухолевых клетках может быть результатом дисбаланса в ядерно-цитоплазматическом перемещении этого белка, вызывающего снижение активного цитоплазматического Rac1 и сопутствующее повышение активного RhoA, что способствует сократимости актомиозина, необходимой для клеточной инвазии.

Среди RhoGAP-белков особенно выделяют семейство DLC-белков (deleted in liver cancer), поскольку именно их инактивация является наиболее частым изменением Rho-регуляторов при развитии опухолевых процессов. При некоторых типах рака утрата DLC1 встречается настолько же часто, как и выпадение опухолевого супрессора р53; так, белок DLC1 отсутствует в клетках различных опухолевых образований (молочной железы, кишечника, лёгких, простаты) по причине инактивации соответствующего ему гена. «Выключение» DLC1 вызывает усиленное образование т.н. активных стрессовых волокон и сопряжено также с повышенной миграционной активностью раковых клеток.
Вообще в геноме человека закодированы три изоформы DLC, имеющие цифровое обозначение от 1 до 3. DLC1-3 обладают схожей структурной организацией и регулируют активность малых ГТФ-аз RhoА и Cdc42. DLC3, например, контролирует передачу сигналов от рецептора фактора роста EGFR и выполняет функцию стабилизации в постоянных клеточных контактах. Утрата функции DLC3 в опухолевых клетках может, с одной стороны, привести к yсилению сигналов в клетку от рецепторов ростовых факторов и, с другой стороны, стать причиной ослабления контактов между структурами эпителиальных тканей, что способствует как возникновению опухоли, так и её метастазированию.

[albert52]

Вставка.

Цитоскелет в норме и при онкологии

Одна животная клетка обладает способностью адаптировать свою форму в ответ на ограничения окружающей среды или химические сигналы, перемещаться по тканям (искусственным и in vivo, включая узкие пространства) и делиться. Все эти процессы, по крайней мере частично, управляются сборкой - разборкой цитоскелетных белков. Для формирования множества различных цитоскелетных структур, как это наблюдается в клетках животных, цитоскелетная сеть нуждается не только в различных компонентах с различными свойствами и функциями, но также в жесткой и точной регуляции (сборке-разборке) ее компонентов, т.е. соответствующая локальная регуляция факторов (дез-)сборки и взаимодействия между сетями актина, микротрубочек и промежуточных филаментов.

В клетках актин встречается в двух различных состояниях: мономерном G-актине и нитевидном F-актине. Модуляция актинового цитоскелета регулируется балансом глобулярного G- и полимерного F-актина и актин-ассоциированными белками. Актиновый цитоскелет образует сеть, состоящую из поляризованных филаментов, которые в основном связаны с генерацией силы, необходимой для движения, фокальной адгезии и изменения формы.
Образующиеся актиновые филаменты имеют правозакрученную спиральную структуру. G-актин поляризован, поэтому F-актин также поляризован, причем менее динамичная сторона называется (-)-концом, а более динамичная (+)-конец, который имеет скорость полимеризации в десять раз выше, чем (-)- конец. Поскольку актин представляет собой АТФазу, (+)- и (-)-концы также можно различить по их АТФ/АДФ-статусу; (+)-конец содержит большее количество актина, связанного с АТФ, в то время как (-)-конец содержит больше актина, связанного с АДФ.

Профилин (Profilin) является актин-связывающим белком, который регулирует гомеостаз актина путем ингибирования спонтанного образования ди- и тримеров актина, а также катализирует переход от АДФ- к АТФ-актину. Связанный с Profilin G-actin может быть использован для построения актиновых филаментов, если присутствуют факторы нуклеации (запуска), такие как комплекс Arp2/3 (actin-related-proteins 2/3) или формины. Нуклеация – соединение трех G-актинов с инициацией полимеризации. Интересно, что если присутствуют формины и профилин, удлинение свободного актина может увеличиваться в 9 раз; профилин также ингибирует полимеризацию на (-)-конце актина.

Некоторые члены семейства форминов также перемещаются с конца филамента в середину, дополнительно функционируя в качестве сшивающих агентов для стабилизации генерируемой структуры. Поскольку формины не обязательно образуют пучки филаментов, другие белки, такие как сшивающие линкеры или Ena/VASP, также участвуют в формин-зависимом образовании пучков. Ena/VASP представляет собой семейство белков, связанных с функцией антикэппинга (кэппинг - это колпачок на конце актиновой нити) и удлинением, но не обладающих активностью нуклеации сами по себе.

Кроме квазилинейных актиновых филаментов существуют дендритные актиновые сети, образованные комплексом Arp2/3. Эти сети обычно формируются на клеточном фронте в течение короткого промежутка времени, поэтому их регуляция имеет большое значение. Генерация дендритной актиновой сети начинается с так называемого праймера - существующего актинового филамента, на котором Arp2/3 соединяется с его стороной; Arp2/3 среди прочего активируется членами семейства WASP. Для образования плотной дендритной сети необходимы не только факторы нуклеации, но и кэпирующие белки, ограничивающие удлинение актиновых (+)-концов.

Если присутствуют кэпирующие белки, комплекс Arp2/3 может генерировать множественные сети, происходящие из разных актиновых филаментов, которые способны сливаться и генерировать силы вблизи клеточной мембраны. Количество узлов важно для механических свойств генерируемой сети, причем дендритная сеть ведет себя вязкоупругой, то есть она в основном эластична в малых временных масштабах (<1 мин) и вязкая в более длительных масштабах времени (>10 мин).

Другим важным классом молекул является семейство миозинов. Миозин отвечает за сократимость антипараллельных актиновых структур, используя гидролиз АТФ в качестве источника энергии. Эти сократительные структуры в основном отвечают за ретракцию (сжатие) задней части клетки для продуктивного движения, а также за передачу сил окружающему внеклеточному матриксу. Миозин II может быть активирован посредством фосфорилирования регуляторной легкой цепи (RLC) или активации киназ легкой цепи миозина (MLCK). RLC активируется с помощью Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) или цитронкиназ (обе активируются RhoA) и MLCK (Myosin light chain kinase) с помощью Ca 2+ .

После фосфорилирования RLC миозин способен генерировать сократительные силы. Другой тип регуляции работает через фосфорилирование тяжелой цепи миозина с использованием киназ тяжелой цепи миозина (MHCK), казеинкиназы II (CKII) или протеинкиназы C (PKC), ингибируя сборку мини-филаментов или диссоциируя существующие мини-филаменты. Переключение между этими двумя состояниями активации влияет на сократимость соответствующей актомиозиновой сети.

Существуют также актиновые пучки и сети, связанные между собой кросс-линкерами. Здесь сшивающие агенты представляют собой молекулы, которые соединяют отдельные актиновые филаменты и являются либо пассивными (например, скруин, фацин, α-актинин, филамин или фимбрин), либо активными (миозин). Сшитые актиновые пучки и сети в значительной степени контролируют форму, механическую целостность и способность клетки к сокращению. Как правило, сшивающие агенты не влияют на сборку актина (за исключением Arp2/3).
Если актиновые филаменты связаны сшивателями, филаменты внутри пучка могут быть ориентированы либо параллельно, либо антипараллельно, что означает, что (+)-концы соседних филаментов указывают в том же или противоположном направлении. Механические свойства (анти-)параллельных пучков зависят от типа и плотности сшивающих агентов и, таким образом, от компактности пучка и от того, допускает ли пучок скольжение одиночных нитей. Параллельные актиновые пучки обнаруживаются среди др. в филоподиях, в то время как антипараллельные пучки в основном обнаруживаются в стрессовых волокнах.

Поскольку большинство актиновых структур стабильны во времени, клеткам необходим механизм, вызывающий разборку актина, чтобы адаптироваться к сигналам окружающей среды. Один из таких механизмов управляется семейством актин-связывающих белков ADF/cofilin, способных разбирать и фрагментировать актиновые филаменты, но не способных изменять скорость полимеризации. Предпочтение более старого актина, связанного с АДФ, подразумевает, что разборка с АДФ/кофилином в основном затрагивает неактивные компартменты актиновой сети.

Глядя на подвижную клетку, чистое движение является результатом множества, в основном актин-зависимых, процессов, а именно: образование выпячиваний в направлении движения, последующая адгезия к субстрату и потеря адгезии на задней части клетки с последующим сокращением. Эти процессы регулируются субклеточными структурами, такими как филоподии и ламеллиподии, регулирующие движение клеток, в то время как стрессовые волокна обеспечивают механическую стабильность и способность к сокращению. Другими типами выпячиваний являются так называемые пузырьки, которые способны регулировать движение клеток независимо от филоподий и ламеллиподий.

Ламеллиподия представляет собой плоскую структуру, в основном связанную с движением клеток, образующуюся в результате полимеризации актина на клеточном фронте, в то время как она деполимеризуется в своей задней части под действием АДФ/кофилина, восполняющего пул G-актина.Наиболее важным фактором образования ламеллиподия является внутренне неактивный комплекс Arp2/3, который активируется комплексом Scar/WAVE в процессе активации небольшой Rho GTPase Rac1 (см. выше). Этому дополнительно способствует присутствие членов семейства Ena/VASP, аккумулирующихся на кончиках ламеллиподий, способствуя дальнейшему удлинению актина и предотвращая кэпирование.

Несмотря на активный комплекс Arp2/3, кэпирующий белок также необходим для ограничения удлинения одиночных филаментов, чтобы они оставались продуктивными и не образовывали пучки с другими некэпированными филаментами или изгибались под нагрузкой.
Для создания стабильной дендритной сети ее сшивают такими белками, как кортактин. Поскольку описанная регуляция с помощью Rac1 приводит к постоянному росту ламеллиподия, она должна быть ограничена петлей отрицательной обратной связи. Одним из возможных механизмов является белок arpin, который ингибирует активность Arp2/3 в ламеллиподии. Было предположено, что arpin рекрутируется с помощью Rac1, т.о., кажется возможным, что активация Rac1 инициирует рост ламеллиподия за счет быстрого рекрутирования Arp2/3 и последующей полимеризации актина, а позже ингибирует его рост за счет рекрутирования arpin.

Помимо динамики актина на ламеллиподию также влияет клеточная мембрана и ее поверхностное натяжение. Более высокое поверхностное натяжение мембран приводит к более ориентированной полимеризации актиновых филаментов, в то время как более низкое натяжение приводит к большему количеству выпячиваний.

Дополнительными структурами, связанными с подвижностью клеток, являются филоподии, которые образуют структуру, состоящую из параллельных пучков актина, причем их (+) -концы направлены в направлении клеточной мембраны. Эта ориентация устанавливается с помощью форминов (например, FMNL2) и Ena/VASP, которые способны поддерживать длительную полимеризацию актина. Затем стабилизация и связывание сшивающими агентами, такими как fascin, генерирует "зрелые" филоподии. Помимо своей роли в клеточном движении, филоподии инициируют межклеточные контакты, передают межклеточные сигналы и реагируют на механические свойства своего окружения.

[albert52]

Продолжим.

Стрессовые волокна представляют собой собранные пучки из 10-30 актиновых филаментов, сшитых α-актинином биполярным образом и связанных фокальными адгезиями; очаговые адгезии представляют собой участки связывания, которые соединяют клетку с субстратом. Сократительные стрессовые волокна являются одним из основных факторов сократительной способности клеток многих животных клеток. В неподвижных клетках стрессовые волокна обычно толстые и относительно стабильные, в то время как подвижные клетки обычно содержат меньше менее выраженных волокон с более высокой динамикой. Актин и миозин являются двумя основными составляющими сократительных стрессовых волокон, в то время как несократительные не содержат миозин.
Стрессовые волокна могут содержать дополнительные сшивающие агенты, такие как фасцин, филамин и паладин; другие молекулы, например, кальпонин, тропомиозин, семейство кальдесмонов и др., обнаружены в стрессовых волокнах, и предполагается, что все они являются частью регуляции цитоскелета и/или стрессовых волокон.

Вообще говоря, образование стрессовых волокон напрямую связано с активацией формина mDia1 и малой Rho GTPase RhoA, активирующей ROCK. Формин способствует длительной полимеризации актина параллельных филаментов, важных для стрессовых волокон, и, кроме того, ROCK активирует миозин, способствуя образованию стрессовых волокон. Тем не менее, как ROCK, так и форминовые механизмы необходимы для образования сократительных стрессовых волокон.
Rho GTPases Cdc42 и Rac1, действуют более опосредованно через индукцию ламеллоподиального роста через Arp2/3 (Rac1) и образование филоподий через формин mDia2 (Cdc42), которые могут функционировать как зародыш как для поперечных, так и для вентральных стрессовых волокон. Последние ориентированы параллельно направлению движения клетки и соединяют места спаек клетки, а поперечные стрессовые волокна могут вносить вклад в общую сократимость благодаря их соединению с дорсальными стрессовыми волокнами. Есть еще дорсальные стрессовые волокна, обычно несократимые, которые генерируются посредством полимеризации актина при появлении фокальных спаек и стабилизируются во время фаз ретракции ламеллиподия посредством сцепления с возникающими поперечными стрессовыми волокнами.

Третьим типом сократительных стрессовых волокон является так называемая перинуклеарная шапочка, состоящая из стрессовых волокон, расположенных над ядром и регулирующих форму ядра. Кроме того, предполагается, что они служат механической связью между ядром и остальной частью клетки. Общим для всех этих типов сократительных стрессовых волокон является то, что они сильно зависят от присутствия и активности миозина и, таким образом, от напряжения. Следовательно, ингибирование миозина приводит к разборке этих стрессовых волокон.

Выделяют еще актиновую кору, которая образует сократительную структуру актина на границе с плазматической мембраной; механические свойства коры определяют, как клетка деформируется в ответ на внешние силы. Более низкое напряжение коры связано с повышенной протрузивной активностью клетки, таким образом косвенно регулируя подвижность клеток. Кора представляет собой слой толщиной в несколько сотен нанометров, состоящий из смеси пучков филаментов; сеть коры в основном изотропна, ориентирована параллельно плазматической мембране, но некоторые филаменты также ориентированы перпендикулярно мембране. Эта кора содержит много малых ГТФ-аз и их мишеней (см. выше).
Интересно, что причиной так называемых пузырей могут быть локальные падения напряжения коры или адгезии коры к мембране, а также локальные разрывы коры - особое, изначально свободное от актина выпячивание мембраны. Максимальный размер пузыря определяется начальной скоростью роста и временем повторной полимеризации коры, оба зависят от натяжения коры. После полного созревания кора реконструируется, и если пузырь не стабилизируется за счет спаек, он втягивается восстановленной корой посредством миозин-индуцированного сокращения. В некоторых подвижных клетках пузыри стабилизируются и используются как альтернативный или дополнительный способ миграции.

Для полноты следует упомянуть, что актин присутствует не только в цитоплазме эукариотических клеток, но и в ядре. Как и в цитоплазме, ядерный актин существует в мономерной и полимерной форме. Показано, что ядерный G-актин связывается со всеми тремя РНК-полимеразами, участвуя в инициации транскрипции и элонгации. На выходе из митоза хроматин реорганизуется в зависимости от временного образования полимерного актина, по-видимому, кофилин-зависимым образом.

Микротрубочки состоят из гетеродимеров α- и β-тубулина, образующих полые филаменты, обычно состоящие из 13 протофиламентов; они демонстрируют поведение, называемое динамической нестабильностью, характеризующееся внезапным переключением с роста на остановку роста и/или быструю деполимеризацию (называемую катастрофой), за которой следует новый цикл роста.
Белки, взаимодействующие с микротрубочками, представляют собой либо белки, связывающие (+)-концы микротрубочек (+TIP), либо структурные белки, ассоциированные с микротрубочками (MAP), взаимодействующие с микротрубочками по их длине. Эти классы белков могут оказывать стабилизирующее или дестабилизирующее действие, изменяя динамику полимеризации или разрывая микротрубочки. Важными белками, принадлежащими к семейству +TIPs, являются CLASPs (белок, ассоциированный с цитоплазматическим линкером) и APC, которые подавляют катастрофические события микротрубочек и способствуют восстановлению после катастрофы.

Другими важными семействами +TIPs являются спектроплакины, связывающие как микротрубочки, так и актин, и EBs (концевые связывающие белки). Предполагается, что EBs являются основным регулятором рекрутирования +TIP (например, CLASP, APC, MACF1 (микротрубочковый-актиновый фактор перекрестного связывания) и комплексной сборки, обычно способствуя персистентному росту микротрубочек. Помимо этих молекул, которые в основном (де-)стабилизируют микротрубочки, существует группа белков, которые разрывают микротрубочки, такие как спастин или катанин или влияют на деполимеризацию и полимеризацию, например, статмин (способствует деполимеризации) или XMPA215 (увеличивает скорость полимеризации).

Важным компонентом MAP являются моторные белки kinesin и dynein, оба служат переносчиками грузов, используя сеть микротрубочек. В целом кинезиновые моторные белки транспортируют груз к (+)-концу, в то время как динеин перемещается к (-)-концу микротрубочек, транспортируя различные типы грузов, включая мембранные компоненты, сигнальные молекулы, такие как малые GTPases Rac и Cdc42, а также промежуточные филаменты и их предшественники, мРНК, кодирующие β-актин, и субъединицы комплекса Arp2/3.
В нейронах кинезин-5 и кинезин-12 необходимы для роста аксонов из-за их способности к поперечному связыванию и сопутствующей концентрации на расширении массивов микротрубочек. Микротрубочки также играют ключевую роль во время разделения хромосом во время клеточного деления. Считается, что деполимеризация микротрубочек создает необходимые силы для разделения сестринских хроматид.

Белки, образующие промежуточные филаменты, представляют собой большой класс белков, кодируемых не менее чем 70 генами, организующими филаменты диаметром 10 нм. Для их зарождения и полимеризации кофакторы не нужны (эволюционно они наиболее древние). Промежуточные филаменты сгруппированы в 5 классов в соответствии с их структурой и гомологией последовательностей. Таким образом, первые четыре класса представляют собой цитоплазматические промежуточные филаменты, а тип V – ядерные филаменты, так называемые ламины (ламин А/С, В1, В2). Еще два промежуточных филамента, называемых филенсин и факинин, нельзя отнести к упомянутым пяти типам; они экспрессируются в эпителии хрусталика, образуя гетерополимеры.
Вблизи коры промежуточные филаменты взаимодействуют с очагами адгезии, десмосомами и полудесмосомами, поддерживая адгезию клеток и тканей. Наоборот, десмосомы и фокальные адгезии функционируют как центры образования de novo промежуточных филаментов. Благодаря закреплению на ядерной и плазматической мембранах промежуточные филаменты образуют каркас для митохондрий, аппарата Гольджи и других органелл и организуют их расположение. Из-за своей сетевой структуры и способности закреплять органеллы промежуточные филаменты часто рассматриваются как механические буферы.

Еще одним фактором, влияющим на организацию промежуточных филаментов, является семейство белков plakin, соединяющих микротрубочки и актин с промежуточными филаментами; некоторые промежуточные филаменты также могут ориентироваться вдоль актинового цитоскелета или микротрубочек. Промежуточные филаменты также связывают ядро ​​с цитоплазматическим цитоскелетом через комплекс LINC (linker of nucleoskeleton and Cytoskeleton), присутствующий на ядерной мембране, связывающийся с плектином и тем самым с промежуточными филаментами. Следовательно, нарушение функции LINC приводит к нарушению передачи силы из-за ослабления связи ядра и цитоскелета.

Другими типами промежуточных филаментов являются ядерные ламины. В то время как ядерные ламины вблизи ядерной периферии образуют сеть филаментов, присутствие кажущихся менее плотными структур ламинов в нуклеоплазме согласуется с наблюдением их более высокой подвижности. Интересно, что нокдаун ламина А ингибирует экспрессию генов, связанных с цитоскелетом актомиозина, как показано в мезенхимальных стволовых клетках.

[Таняюша]

Учёные из Университета Коннектикута выяснили, чем полезны грецкие орехи.

В исследовании приняли участие 39 человек в возрасте от 40 до 65 лет. Все участники прошли многосторонние обследования, включая анализы крови и микрофлоры кишечника.

Выяснили, что высокий уровень уролитина А в организме связан с пониженным риском возникновения рака кишечника. Грецкие орехи содержат эллагитанины, которые обладают противовоспалительными и противораковыми свойствами и способствуют увеличению содержания уролитина А в крови со временем, пишет издание ИАНЕД.

Употр***ение грецкого ореха повышает уровень пептида YY - гормона, подавляющего рост опухолей. Учёные предположили, что грецкие орехи способны не только снижать риск рака, но и замедлять рост уже имеющихся злокачественных образований.